Virus unter dem Mikroskop: von der Bildgebung zur Manipulation

Virus unter dem Mikroskop: von der Bildgebung zur Manipulation

Denis Kornejew
"Wissenschaft erste Hand" № 3/4 (57/58), 2014

Viren sind extrem kleine Objekte, deren Größe von einigen zehn bis zu einigen hundert Nanometern reicht. Die erste und seit mehreren Jahrzehnten einzige Methode ihrer Visualisierung war die Elektronenmikroskopie, die es ermöglichte, nicht nur die Struktur der Viruspartikel selbst, Virionen genannt, genauer zu untersuchen, sondern auch die Vorgänge in der infizierten Zelle – die Replikation des Virus – zu untersuchen. Das "Monopol" der Elektronenmikroskopie wurde durch das Erscheinen einer grundlegend neuen Klasse von Geräten – Rastersondenmikroskopen – Anfang der 1980er Jahre gebrochen.

Das zu dieser Klasse gehörende Rasterkraftmikroskop erwies sich als ein Werkzeug, das sich für die Untersuchung biologischer Objekte eignete und es ermöglichte, nanoskalige Strukturen nicht nur zu visualisieren, sondern auch zu manipulieren. Insbesondere die Manipulation einzelner Virionen und die direkte Messung der aus ihrem Kontakt mit der Zelloberfläche resultierenden Kräfte erwiesen sich als grundsätzlich möglich. Solche Experimente erlauben es, detaillierte Daten über das erste und in vielen Fällen noch unzureichend untersuchte Stadium der Zellinfektion zu erhalten – die Adhäsion des Virus an seiner Oberfläche.Diese Studien sind von beträchtlichem praktischen Interesse, da kann der Schlüssel zur Schaffung wirksamer antiviraler Medikamente sein, die Zellen vor dem Eindringen von Viren schützen.

Über den Autor

Denis Vladimirovich Korneev – Forscher, Labor für Ultrastrukturforschung, Vorsitzender des Rates der jungen Wissenschaftler des staatlichen wissenschaftlichen Zentrums für Virologie und Biotechnologie "Vector" (Nowosibirsker Region, Koltsovo). Autor und Co-Autor von 11 wissenschaftlichen Arbeiten.

Im berühmten Lied von Vladimir Vysotsky wird es gesungen: "… Sie werden kein Neutrino vom Bart fangen / Und Sie werden es in ein Reagenzglas nicht setzen …". Natürlich ist ein Virus kein Neutrino, kein Atom oder gar ein Molekül, sondern ein Objekt, das so klein ist, dass es nicht nur mit dem Auge, sondern auch mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop gesehen werden kann. Die Elektronenmikroskopie, die die Möglichkeiten unserer Vision hunderttausendfach erhöhte, machte es jedoch möglich, diese erstaunlichen Objekte nicht nur zu sehen, sondern auch bis ins kleinste Detail zu untersuchen. Und die Rasterkraftmikroskopie, die unseren Tastsinn noch schärfer machte, erlaubte uns die direkte mechanische Manipulation von Viruspartikeln.

Viren sind extrem kleine Objekte – ihre Größe liegt zwischen einigen zehn und einigen hundert Nanometern. Die erste und lange Zeit die einzige Methode zur direkten Visualisierung von nanoskaligen Partikeln war Elektronenmikroskopie (EM), die sich in den 1930er Jahren zu entwickeln begann. Die Methode, die sich als sehr informativ erwies, ermöglichte nicht nur die detaillierte Beschreibung der Struktur verschiedener Viren, sondern auch die Untersuchung der Vorgänge in der infizierten Zelle.

Es stellte sich heraus, dass sich die Form der viralen Partikel durch eine große Vielfalt unterscheidet: von normalen Sphären zu komplexen Strukturen, die Ziegel ähneln, die mit Tubuli (Variola-Virus) oder Borstenwürmern geklebt sind (Ebola hemorrhagic fieber virus).

Für die Strategie wurde eine größere Vielfalt gefunden Replikationen (Reproduktion) von Viren. Die einzige grundlegende Eigenschaft, die allen Viren ohne Ausnahme gemeinsam war, war ihr Status als obligat intrazellulärer Parasit. Dies bedeutet, dass das genetische Material, um das Virus zu vermehren, notwendigerweise in die lebende Zelle eindringen und seinen enzymatischen Apparat "einfangen" muss, indem er diesen auf Kopien des Virus umstellt.

Außerhalb der Zelle ist jedes Virus nur ein molekularer Behälter mit genetischem Material (DNA oder RNA) und kann kaum als vollwertiger lebender Organismus betrachtet werden, obwohl es in der wissenschaftlichen Gemeinschaft noch keine definitive terminologische Gewissheit zu diesem Thema gibt.

Die Spezifität der Elektronenmikroskopie ist die Studie behobendas heißt, Objekte, die auf eine besondere Art und Weise vorbereitet sind – tatsächlich funktioniert es nur mit toter Materie*. Da der Forscher nur "eingefrorene Momente" hat, kann er nur Hypothesen über die Dynamik der untersuchten Prozesse erstellen, da er nicht in der Lage ist, ihren Fluss in Echtzeit zu beobachten.

Daher ist die Untersuchung der Virusreplikation durch Transmissionselektronenmikroskopie an ultradünnen Abschnitten wie folgt: Die infizierten Zellen werden mit Fixierlösung behandelt, mit Alkohol dehydriert und mit einem speziellen Harz gegossen. Nach dem Aushärten des Harzes mit einem speziellen Gerät – einem Ultratom – werden ultradünne (≈ 50 nm) Schnitte angefertigt, die dann auf ein spezielles Gitter aufgetragen und mit Schwermetallsalzlösungen behandelt werden. Während der mikroskopischen Untersuchung befindet sich die Probe in einer Vakuumkammer und wird einem Elektronenstrahl ausgesetzt.mit einer Energie von mehreren zehn keV. Offensichtlich ist die intravitale Bildgebung in diesem Fall grundsätzlich unmöglich.

Seit fast einem halben Jahrhundert ist die Elektronenmikroskopie die einzige Methode zur Visualisierung nanoskaliger Objekte. Aber in den frühen 1980er Jahren. Dieses Monopol wurde durch das Aufkommen gebrochen Rastersondenmikroskopie (SPM). Das Hauptprinzip von SPM ist scannen – Präzision (mit hoher Genauigkeit) Bewegung der Sonde in der Nähe der zu untersuchenden Oberfläche, gekoppelt mit der Verfolgung eines spezifischen Parameters, der die Wechselwirkung zwischen der Sonde und der Probe charakterisiert. Das Ergebnis dieses Scans ist eine topographische Karte der Oberfläche der Probe.

Das erste Gerät SPM wurde Rastertunnelmikroskop (STM), die nur sehr eingeschränkt für die Visualisierung von biologischen Objekten verwendet werden konnte, da ihre Arbeit eine hohe elektrische Leitfähigkeit der untersuchten Oberfläche erforderte.

1986 schufen der Schweizer Physiker G. Binnig und seine Kollegen ein neues Gerät der SPM-Familie – Rasterkraftmikroskop (AFM). Die Grundlage seiner Arbeit ist die Kraft (Van der Waals) Wechselwirkung der Atome der Sonde und der Oberfläche.AFM benötigt keine elektrische Leitfähigkeit der Probenoberfläche und kann Untersuchungen in einem flüssigen Medium durchführen. Daher erwies sich dieses Gerät als ein bequemes Werkzeug für das Studium biologischer Objekte.

Schematische Darstellung des Rasterkraftmikroskops (AFM). Das empfindliche Element des AFM ist eine elastische Konsole (Cantilever), an deren Ende eine akute Sonde befestigt ist. Die Kräfte, die zwischen den Atomen der Spitze der Sonde und der zu untersuchenden Oberfläche entstehen, führen zur Deformation des Cantilevers, der wiederum mittels eines optischen Systems fixiert wird, das in den meisten modernen AFMs basierend auf einem Halbleiterlaser und einem vierteiligen Photodetektor implementiert ist. Die Größe des Cantilevers beträgt 100 × 300 × 20 × 40 μm mit einer Dicke von ca. 2 μm. Sondenhöhe – etwa 10 Mikrometer

Seit dem Aufkommen des Rasterkraftmikroskops wurde eine große Anzahl von Arbeiten zur AFM-Bildgebung einer Vielzahl biologischer Proben veröffentlicht. Es sollte jedoch erkannt werden, dass AFM in den meisten Fällen im Vergleich zur konventionellen Elektronenmikroskopie nichts grundsätzlich Neues bietet, daher wird diese Methode von Biologen oft als technische Exotik und nicht als vollwertiges Forschungsinstrument wahrgenommen.

Der wichtigste, wenn auch fast einzige Vorteil der Visualisierung von biologischen Objekten mit AFM im Vergleich zur Elektronenmikroskopie ist die Fähigkeit, an nativen, natürlichen Proben ohne Fixierung und spezielle Probenvorbereitung mit physiologischen Parametern der Umgebung zu forschen.

Neben der Visualisierung des Oberflächenreliefs mit Subnanometer-Auflösung ermöglicht das AFM eine direkte Messung der Kräfte, die durch die Wechselwirkung einzelner nanoskaliger Objekte entstehen.

Solche Messungen werden wie folgt durchgeführt: Ein Objekt wird an der Spitze der AFM-Sonde befestigt und das zweite Objekt wird auf dem Substrat fixiert, wonach die Sonde bis zum mechanischen Kontakt an die Oberfläche des Substrats gebracht wird und dann zurückkehrt. Während dieser Bewegung wird die Verformung des elastischen Cantilevers (Freischwinger). Die Abhängigkeit dieses Parameters von der Entfernung zwischen der Sonde und dem Substrat wird bezeichnet Kraftkurve. Mit seiner Hilfe ist es möglich, die Größe der Kraft zu bestimmen, die zwischen den untersuchten Objekten wirkt. Diese Methode, benannt Atomkraftspektroskopie (ACC) können verwendet werden, um die Leistungseigenschaften der Wechselwirkung einer Vielzahl kleiner Objekte zu untersuchen: von anorganischen Nanopartikeln zu Viren und lebenden Zellen.

Die Methode der Atomkraftspektroskopie erlaubt es, die Größe der Kraft zu bestimmen, die zwischen den untersuchten Objekten wirkt. Dazu wird ein Objekt auf der Spitze der AFM-Sonde fixiert und das zweite Objekt auf dem Substrat fixiert. Die Sonde wird auf die Oberfläche des Substrats aufgebracht und steigt dann zurück. Die Abhängigkeit der Verformung des Cantilevers vom Abstand zwischen der Sonde und dem Substrat wird als Kraftkurve bezeichnet.

Das Anfangsstadium der Infektion einer Zelle mit einem Virus ist Haftung (Anheften) des Viruspartikels (Virion) an die Zelloberfläche, gefolgt von der Penetration des genetischen Materials des Virus in die Zelle. Dieser Prozess, der durch die Interaktion von Proteinrezeptoren auf der Zelloberfläche mit den Oberflächenproteinen des Virions bestimmt wird, ist entscheidend für die Vermehrung des Virus. Und es sollte angemerkt werden, dass in den meisten Fällen nicht genug untersucht wird.

Die wirklich aufregenden Aussichten für die Forschung in dieser Richtung öffnen die ACC.Durch Fixierung eines einzelnen Viruspartikels auf der Spitze der AFM-Sonde ist es möglich, die Kraft zu messen, die auftritt, wenn ein Viruspartikel die Zelloberfläche berührt, die kinetischen Eigenschaften dieser Wechselwirkung zu untersuchen und sogar das Virion innerhalb der Zelle unter gleichzeitiger Beobachtung mit einem starken Lichtmikroskop zu drücken. In einem solchen Experiment wird ein Forscher von einem passiven Beobachter zu einem aktiven Teilnehmer an dem Prozess, der eine mechanische Manipulation des zu untersuchenden nanoskaligen Objekts durchführt – keine der anderen Arten von Mikroskopie kann eine solche Möglichkeit bieten.

Das Fixieren eines einzelnen Viruspartikels auf der Spitze einer Rasterkraftmikroskopsonde ist jedoch eine sehr schwierige Aufgabe. Für ein erfolgreiches Experiment sind viele Vorbereitungsarbeiten erforderlich:

  • Holen Sie sich die reinste und konzentrierteste Zubereitung des Virus;
  • Bereiten Sie auf der Spitze der Sonde eine Landung geeigneter Größe für eine Virionlandung vor;
  • chemisch die Oberfläche der Sonde aktivieren, um bei Kontakt mit Virusproteinen kovalente Bindungen zu bilden;
  • Stellen Sie sicher, dass das Virion wirklich auf der Sonde fixiert ist, und nicht freie Proteinmoleküle oder kleine Zellfragmente, die immer in den Präparaten von Viren vorhanden sind.

Die Beurteilung der Konzentration und Reinheit des Arzneimittelvirus erfolgt üblicherweise durch Transmissionselektronenmikroskopie. Die Kontaktstelle auf der Spitze der AFM-Sonde, die normalerweise aus Silizium oder seinem Nitrid besteht, wird durch Langzeitabtastung eines Silizium- oder Saphirsubstrats für große Werte der Überstreichungs- und Druckkraft der Sonde an die Oberfläche gebildet. Die anschaulichste Illustration dieses Prozesses ist die Veränderung der Form der Bleistiftspitze beim intensiven Zeichnen.

Angemessene Methode zur Überwachung der geometrischen Parameter des Sonden-Rasterkraftmikroskops (a) Bei der Erstellung eines Standortes für die Landung eines Virions handelt es sich um Elektronenmikroskopie, sowohl scannend als auch transluzent:b – eine Plattform an der Spitze der Sonde zum Einpflanzen eines großen Viruspartikels; in der – virusähnliche Partikel, die an der Spitze der Sonde fixiert sind. Transmissionselektronenmikroskopie (JEM 1400, Jeol, Japan)

Die Hauptfrage, die bei der Interpretation von Ergebnissen der Atomkraftspektroskopie beantwortet werden muss, kann wie folgt formuliert werden: "Die Kräfte zwischen welchen Objekten wurden gemessen?"

Nach den Standards der Mikroskopie,die Zelle höherer Organismen ist ein relativ großes (≈ 10 μm) Objekt, daher ist es im Lichtmikroskop gut sichtbar, mit dessen Hilfe ein Cantilever eines Rasterkraftmikroskops darauf zielt. Aber was ist mit der Sonde selbst, an deren Spitze ein Virion vorhanden sein soll? Streng genommen kann es anstelle eines Virions alles geben: eine Monoschicht von Proteinmolekülen, ein Fragment einer Zelle oder eines Virions, ein Aggregat mehrerer Virionen, eine zufällige Kontamination usw. Zusätzlich kann das Virion während der Messung von der Sonde zerstört oder abgelöst werden. Eine Visualisierung der Sonde mit einem Viruspartikel durch Elektronenmikroskopie vor Leistungsmessungen ist jedoch nicht akzeptabel, da unter dem Einfluss von Trocknung, Vakuum und Elektronenstrahl das Virion irreversible Veränderungen erfährt.

Die effektivste Methode zur Lösung dieses Problems war die Visualisierung der Spitze der AFM-Sonde mittels Elektronenmikroskopie, die unmittelbar nach den Kraftmessungen durchgeführt wurde. Wenn ein Viruspartikel an der Spitze gefunden wird, die das Experiment überlebt hat, werden alle Zweifel verschwinden.

In den letzten fünfzig Jahren, als Ergebnis der wirklich titanischen Arbeit von Elektronenmikroskopie auf der ganzen Welt,Im Bereich der ultrastrukturellen Aspekte der Replikation verschiedener Viren hat sich ein riesiger Wissensschatz angesammelt. Die Schaffung eines Rasterkraftmikroskops und einer Kraftspektroskopie-Technik ermöglichten eine genaue Annäherung an beliebige mechanische Manipulationen mit einzelnen Viruspartikeln. Dadurch wird die Interaktion des Virus mit der Zelle auf ein grundlegend anderes Niveau untersucht – von strukturellen Studien bis hin zu funktionellen Studien.

Gleichzeitig ist die Atomkraftspektroskopie kein Konkurrent für die Elektronenmikroskopie, sondern eröffnet eine neue unabhängige Forschungsrichtung – die Nanomechanik der Wechselwirkung eines Viruspartikels mit der Zelloberfläche. Es ist sehr wahrscheinlich, dass in naher Zukunft grundlegende Entdeckungen in dieser Richtung gemacht werden, die den Errungenschaften der Elektronenmikroskopie in der Mitte des letzten Jahrhunderts entsprechen.

Die Untersuchung der Bindungsmechanismen von Viruspartikeln mit der Zelloberfläche ist nicht nur aus der Sicht der Grundlagenforschung, sondern auch im Rahmen praktischer Anwendungen von erheblichem Interesse. Ein detaillierteres Verständnis dieser Mechanismen auf molekularer Ebene kann der Menschheit den Schlüssel zur Schaffung effektiver antiviraler Medikamente geben,Schutz der Zellen vor Viren.

Die Veröffentlichung verwendete das Foto des Autors

Literatur
1. Korneev D. V., Bessudnova E. V., Zaitsev B.N. Untersuchung der Wechselwirkung von TiO-Nanopartikeln2 und die Oberfläche von menschlichen Erythrozyten durch Atomkraftspektroskopie // UNZH. 2012 Nr. 4. P. 73-77.
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* Die Transmissionselektronenmikroskopie mit einer speziellen Flüssigkeitszelle und die Rasterelektronenmikroskopie bei Atmosphärendruck ermöglichen die Untersuchung biologischer Objekte ohne Fixierung, aber aufgrund einer Reihe von technischen Schwierigkeiten und relativ geringer räumlicher Auflösung sind diese Methoden nicht weit verbreitet.


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