Nobelpreis für Chemie - 2018 • Tatiana Romanovskaya • Science News zu "Elementen" • Nobelpreise, Chemie, Molekularbiologie

Nobelpreis für Chemie – 2018

Abb. 1. Gewinner des Nobelpreises für Chemie im Jahr 2018. Von links nach rechts: Frances H. Arnold, George P. Smith und Sir Gregory P. Winter. Fotos von sciencebews.org

Der Nobelpreis für Chemie im Jahr 2018 wurde von drei Wissenschaftlern geteilt: Die Hälfte des Preises ging an den amerikanischen Forscher Francis Arnold "für die gerichtete Evolution von Enzymen", die zweite Hälfte wurde vom Amerikaner George Smith und Greg Winter aus Großbritannien geteilt – "für Phagen-Display von Peptiden und Antikörpern". Die Studien, die den Preis gewonnen haben, haben einen ausgeprägten angewandten Charakter, und sie sind dadurch vereint, dass sich alle Autoren mit der Entwicklung von Methoden zur Gewinnung nützlicher Proteine ​​und Peptide für Menschen auf der Grundlage der natürlichen "Methode" der biologischen Evolution, nämlich einer Kombination zufälliger Variabilität, befassen und nicht zufällige Auswahl. Alle Gewinner haben einen langen Weg der Forschungsarbeit und viele prestigeträchtige Auszeichnungen und Preise.

Proteine ​​(auch als Polypeptide bezeichnet) sind die wichtigste Klasse von Biopolymeren. Jedes Polypeptid ist eine Kette von Aminosäuren, die eine nach der anderen miteinander verbunden sind, deren Anzahl sehr unterschiedlich sein kann, von ein paar Stücken bis zu ein paar hundert, und manchmal können sie sogar mehr als tausend sein.Kurze Ketten (weniger als einhundert Aminosäuren) werden üblicherweise nicht Proteine, sondern Peptide genannt: Der Unterschied ist hier quantitativer als qualitativ. In der Natur werden Proteine ​​hauptsächlich aus zwanzig verschiedenen Aminosäuren aufgebaut. Die Polypeptidketten werden dann auf eine bestimmte Art und Weise gefaltet und erhalten verschiedene räumliche Konfigurationen, die sich in so etwas wie die Details des LEGO-Designers verwandeln (Abb. 2).

Abb. 2 Beispiele für Proteinmoleküle; Modelle ihrer dreidimensionalen Konfiguration werden gezeigt. Bild von L. L. Porter, G.D. Rose, 2012. Eine thermodynamische Definition von Proteindomänen

Die Bedeutung von Proteinen für Wildtiere kann nicht genug betont werden. Erstens sind Proteine ​​die Bausteine, aus denen die lebenden Zellen selbst aufgebaut sind, und das Skelett der interzellulären Substanz, an die sich die Zellen anlagern. Sie können visuell sicherstellen, dass, wenn Sie zum Beispiel das Herz nehmen und alle Zellen daraus entfernen (dieses Verfahren wird Dezellularisierung genannt), der Proteinkern, der übrig bleibt, vollständig die Form eines ganzen Körpers behalten wird (siehe das Bild des Tages "Dezellularisiertes Herz").

Zweitens sind ein bedeutender Teil von Proteinen Enzyme, das heißt, sie sind biologische Katalysatoren, die eine Anzahl von wichtigen charakteristischen Eigenschaften und Vorteilen im Vergleich zu herkömmlichen chemischen Katalysatoren von Nicht-Protein-Charakter aufweisen.Nämlich eine ungewöhnlich hohe Effizienz, Spezifität für einen bestimmten Substrattyp und Kontrollierbarkeit: Das Enzym kann unter dem Einfluss bestimmter äußerer Faktoren oder durch Wechselwirkung mit einem anderen Protein von der aktiven zur inaktiven Form übergehen und umgekehrt.

Drittens dienen einige Proteine ​​- Antikörper – als Nano-Waffen gegen feindliche Agenten (Bakterien, Viren oder Toxine), die aus der äußeren Umgebung in den Körper gelangen und so eine Schutzfunktion ausüben. Dies wird durch die Fähigkeit von Antikörpern sichergestellt, sich fest an eine große Vielzahl von Antigenmolekülen zu binden.

Und dann gibt es Rezeptorproteine, die es lebenden Zellen ermöglichen, Signale (chemisch oder physikalisch) von der äußeren Umgebung wahrzunehmen, sowie Regulatorproteine, die die Reaktionen von Zellen auf empfangene Signale kontrollieren, insbesondere durch Aktivierung oder Inaktivierung bestimmter Enzyme (Rezeptoren und Ein weiterer Nobelpreis dieses Jahres ist gewidmet – in Physiologie und Medizin, siehe Nachrichten Nobelpreis für Physiologie und Medizin – 2018, "Elements", 04.10.2018).

Es ist nicht verwunderlich, dass die Menschen die Aussichten sehen, diese bemerkenswerten Moleküle zu zähmen, um eine Vielzahl von Aufgaben zu lösen, die über rein natürliche Prozesse hinausgehen.Wir möchten neue Arten von Katalysatoren entwickeln, die nicht von der Natur selbst erfunden wurden, sowie Proteine ​​und Peptide, die jede Art von Molekülen, die uns interessieren, effektiv binden würden.

Um neue Proteine ​​mit gegebenen Eigenschaften zu erhalten, müssen sie theoretisch zuerst erfunden werden. Die Eigenschaften von Proteinen hängen von der räumlichen Konformation des Proteinmoleküls sowie von der Verteilung elektrischer Ladungen im Molekül ab. Diese Eigenschaften werden wiederum durch die Eigenschaften der Aminosäuren bestimmt, aus denen das Protein besteht. Darüber hinaus ist es wichtig, nicht nur welche Aminosäuren und in welcher Menge sie in die Kette gelangen, sondern auch in welcher Reihenfolge sie sich befinden. Theoretisch könnte man, wenn man die Eigenschaften von Aminosäuren und die Struktur der Polypeptidkette kennt, die Konfiguration und die chemischen Eigenschaften des endgültigen Proteins vorhersagen. Und wenn ja, warum erfinden Sie dann Proteine ​​nicht für ihre Zwecke neu, wie Ingenieure alle möglichen technischen Geräte erfinden – vom Kugelschreiber bis zum Computer? Ach, nicht so einfach. Tatsache ist, dass oft für die gleiche Kette von Aminosäuren mehrere mögliche stabile Konfigurationen existieren, und zusätzlich kann sich die Konfiguration zum Zeitpunkt der Wechselwirkung mit anderen Molekülen in der Reaktionsmischung aufgrund der Umverteilung von Ladungen im Molekül ändern.All dies macht es extrem schwierig für das "rationale Design" neuer essentieller Proteine ​​und Peptide.

Es gibt einen Ausweg aus dieser Schwierigkeit, und er wurde vor Milliarden von Jahren von der Natur selbst erfunden – es ist eine Versuch-und-Irrtum-Methode: zufällige Vielfalt zu erzeugen und dann Produkte auszuwählen, die die notwendigen Eigenschaften haben. Dies ist in der Tat die "Methode" der natürlichen Evolution von Proteinen, und um das Prinzip der darwinistischen Evolution für Laboratoriumsprotein-Engineering zu zähmen, wurde in diesem Jahr der Nobelpreis für Chemie verliehen.

Der Preis ist aus gutem Grund in zwei Teile geteilt – die von Frances H. Arnold für die "gerichtete Evolution von Enzymen" verwendeten Ansätze unterscheiden sich signifikant von dem von George P. Smith entwickelten und von Greg Winter adaptierten Ansatz des "phage display" P. Winter), um spezifische Peptide und Antikörper zu erhalten. Daher betrachten wir diese beiden Teile auch separat.

Abb. 3 Ein Poster neben dem Labor von Francis Arnold am Caltech. Foto © N.V.

Francis Arnold erhielt 1993 ihr erstes "nicht-natürliches" Enzym (K. Chen, F.H. Arnold, 1993. Tuning für Dimethylformamid).Dann wurde eine neue Variante des Enzyms Subtilisin E erhalten, das die Spaltung und Bildung von Peptidbindungen (Verbindungen zwischen Aminosäuren in Peptidketten) katalysiert, und dank der Methode der gerichteten Evolution und Einführung von 10 Aminosäuresubstitutionen in das ursprüngliche natürliche Protein konnte das Enzym in einem organischen Lösungsmittel arbeiten ( 60% Dimethylformamid) und erhöhen die thermische Stabilität um 18 Grad. Aus technischen Gründen ist es oft notwendig, einige Reaktionen der chemischen Synthese in organischen Lösungsmitteln bei erhöhten Temperaturen durchzuführen, daher ist dieses Ergebnis von großer Bedeutung für die praktische Chemie.

Die Arbeit durchlief folgende Phasen: Zunächst wurde ein geeignetes natürliches Gen gefunden. Die Auswahl des zu startenden Gens ist nicht immer eine einfache Frage. Laut Frances Arnold selbst ist es manchmal eine Frage der Intuition. Aber das allgemeine Prinzip ist, wenn möglich, zu versuchen, ein Protein zu finden, das die Fähigkeit zeigt, die gewünschte Reaktion zumindest in einem sehr schwachen Grad zu katalysieren. Das ausgewählte Gen wurde in das Plasmid (zirkuläres DNA-Molekül) inseriert, so dass es in Bakterien – intestinalen Stäbchen – vermehrt werden konnte – dies ist ein ziemlich Standardverfahren in der Gentechnik (siehe die detaillierte Beschreibung davon).Weiterhin wurden unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vier vorgefertigte Substitutionen in dieses Gen eingeführt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Wissenschaftler durch Berechnungen auf der Grundlage von Computersimulationen geführt. Diese Ersetzungen sollten die Form des aktiven Zentrums des Enzyms in der gewünschten Richtung geändert haben und seinen effizienteren Betrieb unter den erforderlichen Bedingungen gewährleisten. Die notwendigen Substitutionen wurden unter Verwendung von Primern eingeführt, die substituierte Nukleotide enthielten. Dann liegt es an den Bakterien – im Prozess des Wachstums und der Teilung multiplizieren sie das Plasmid und synthetisieren gleichzeitig das Protein, das in diesem Plasmid kodiert wird. Danach wird das Protein isoliert und auf das Niveau der Enzymaktivität getestet.

Die Aktivität war immer noch zu niedrig. Um das Ergebnis zu verbessern, wurde das Gen in der nächsten Stufe durch drei Runden "mutagener PCR" durchlaufen. Bei einer solchen PCR werden Mutationen zufällig aufgrund speziell ausgewählter Bedingungen eingeführt, bei denen das DNA-Polymerase-Enzym häufiger als gewöhnlich "Fehler" macht. Nach jeder Runde wurden die Gene in Bakterien eingeführt, das Enzym wurde isoliert und ein Screening (Massenprüfung) wurde durchgeführt, um die am effizientesten arbeitende Variante zu finden.Infolgedessen erschienen sechs zusätzliche Auswechslungen im Eichhörnchen, und, voila! – das erforderliche hochwirksame Enzym erhalten.

In der Zukunft haben Francis Arnold und andere Forscher, die die von ihr vorgeschlagene Methode übernommen haben, viele nützlichere Enzyme mit ungewöhnlichen Eigenschaften erhalten. Die Technik wurde verbessert: Methoden wurden hinzugefügt, um zufällige Mutationen zu erzeugen, die auch für den zufälligen Austausch von Regionen zwischen mutierten Sequenzen sorgen. Oder alternativ wird der Austausch von Bereichen zwischen natürlichen Genen, die eine große Genfamilie bilden, verwendet – während der Entwicklungsgeschichte haben sie natürlicherweise viele Mutationen angesammelt, und ein kombinatorischer Ansatz kann auf dieser Basis helfen, Enzyme mit neuen Eigenschaften zu erhalten.

Daher erwies sich die Arbeit zur Gewinnung von Katalysatoren für ungewöhnliche chemische Reaktionen mit der P450-Familie von Cytochrom-Genen als sehr fruchtbar. In Abb. 4 zeigt eine teilweise Liste von natürlichen und "unnatürlichen" Reaktionen, die durch diese Gruppe von Enzymen katalysiert werden.

Abb. 4 Reaktionen, die durch natürliches Cytochrom P450 katalysiert werden (in der linken Hälfte der Figur, auf einem blauen Hintergrund) und neue Enzyme, die auf der Grundlage der Methode der gerichteten Evolution erhalten wurden: 1 – Cyclopropanierung, 2 – Azidierung, 3 – Sulfidierung, 4 – Aminierung der CH-Bindung, 5 – Einfügen von N-H-Kommunikation. Im Zentrum zeigt ein verallgemeinertes Modell der dreidimensionalen Konfiguration von Cytochrom P450. Schreibweise: R ist ein beliebiger Rest, Ar ist ein aromatischer Rest, Ts ist Tosyl. Die Reaktionen auf einem rosa Hintergrund sind in der Natur nicht vorhanden (oder wurden zumindest noch nicht entdeckt). Abbildung aus Artikel F. Arnold, 2015. Die Natur der chemischen Innovation: neue Enzyme durch Evolution

Das allgemeine Schema der gerichteten Evolution von Enzymen in seiner modernen Form ist in Abb. 5

Abb. 5 Diagramm der im Protein Engineering verwendeten Prozesse. Die Methode der "zufälligen Suche", die der gerichteten Evolution von Proteinen zugrunde liegt (auf der linken Seite), können in gewissem Maße mit einem rationalen Design kombiniert werden, das auf der Kenntnis der Gesetze der Beziehung zwischen der Struktur und den Funktionen von Proteinen basiert, die in virtuellen Modellierungsprogrammen verwendet werden. Abbildung aus Artikel V. Stepankova et al., 2013. Strategien für Enzyme in organischen Lösungsmitteln

Die praktische Arbeit von Francis Arnold ist also, dass es mit der von ihr vorgeschlagenen Methode möglich ist, Katalysatoren für die Reaktionen in der pharmazeutischen Industrie und für die Synthese von künstlichen zu erhaltenMaterialien, die entweder nicht in der Natur vorkommen (beispielsweise die Bildung einer Bindung zwischen dem Kohlenstoffatom und dem Siliciumatom) oder unter abnormalen Bedingungen (in Gegenwart von organischen Lösungsmitteln oder Chemikalien, bei hohen oder niedrigen Temperaturen usw.) durchgeführt werden müssen. Darüber hinaus gibt es einen fundamentalen Wert: Je mehr Laboratorien verschiedener Proteine ​​gewonnen werden, deren chemische und physikalische Eigenschaften anschließend untersucht und verglichen werden, desto besser ist das Vorhersagevermögen der virtuellen Modelle für das gezielte Design der gewünschten Proteine ​​oder für die Vorhersage Eigenschaften noch unerforschte natürliche Proteine.

Sprechen wir nun über die Phage-Display-Methode. Die ursprüngliche Version der Methode wurde 1985 von George Smith entwickelt. Die Methode basiert auf der Verwendung von Bakteriophagen M13, der sich in Bakterien vermehrt – Darmstäbchen (E. coli). Phage M13 ist insofern gut, als sein Kapsid groß genug ist, um das Phagengenom zusammen mit Inserts, sogar großen, aufzunehmen. Die Essenz des Phagen-Display-Verfahrens besteht darin, dass ein Fragment, das für ein Peptid von Interesse ist, oder ein ganzes Protein oder eine Reihe verschiedener Fragmente in das Bakteriophagen-Genom inseriert wird.In seiner einfachsten Form kann dies eine Sammlung von völlig zufälligen Sequenzen sein. Die Einbettung erfolgt im Leseraster eines der für Kapsidproteine ​​kodierenden Gene (in M13 gibt es fünf solcher Proteine). Als Ergebnis einer solchen Insertion des Fragments werden in diesem Fragment codierte Peptide (in Verbindung mit den Phageneigenen Proteinen) in dem Fragment codiert. Phagen vermehren sich in Bakterien – und wenn sie sich vermehren, mutieren sie mit einer gewissen Häufigkeit. Als Ergebnis erhalten wir nach dem Extrahieren von Phagenpartikeln aus infizierten Bakterien (Milliarden von Partikeln pro Runde) einen Satz verschiedener Versionen des ursprünglich insertierten Fragments und des Peptids, für das dieses Fragment kodiert. All diese Versionen werden auf der Oberfläche von Phagen präsentiert – das ist das "Phage Display". So erhalten wir die primäre Bibliothek von Phagenpartikeln.

Die Phagenteilchen können dann aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, an die gewünschten Moleküle zu binden, und dann können diejenigen Teilchen, die ausgewählt wurden, weil sie besser binden als andere, wieder verwendet werden, um Bakterien zu infizieren. Die Selektion erfolgt mit Cellulosefiltern oder magnetischen Beads,auf dem die notwendigen Moleküle fixiert sind (um eine Vorstellung davon zu bekommen, wie die notwendigen Moleküle für magnetische Kügelchen gesammelt werden, kann man sich ein kleines Video ansehen). Die "richtigen" Phagen werden in den Medien bleiben und die "falschen" werden rücksichtslos weggespült werden. Die Praxis des Phagen-Displays zeigt, dass nur fünf Runden ausreichen, um Peptide mit sehr hoher Bindungseffizienz zu erhalten. Dann werden DNA-Proben, die aus Phagen isoliert wurden, sequenziert, und auf der Grundlage der ausgewählten Selektionssequenz kann der Forscher genetische Konstrukte bilden, die es ermöglichen, die notwendigen Proteine ​​in den erforderlichen Mengen in jedem geeigneten Objekt zu erhalten – zum Beispiel in den gleichen Darminhaltsstoffen oder Hefe. Diese Methode, Greg Winter, ein anderer Preisträger, adaptierte Antikörper gegen spezifische Antigene. Das von ihm verwendete Schema ist in Abb. 6

Abb. 6 Schema zum Erhalten von Antikörpern durch Phagendisplay. Bild von C. J. Rossant et al., 2014. CXCR2

Ein wesentlicher Vorteil der Methode von Winter ist in erster Linie die Vermeidung der Notwendigkeit, immunisierte Tiere zu verwenden, um Antikörper und Hybridome (Hybride von Lymphozyten und Krebszellen) für ihre Massenproduktion herzustellen. Phage Display – schneller, billiger und humane Technik.Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren reine menschliche Antikörper zu erhalten, was wichtig ist, wenn der Antikörper als Medikament verwendet – weil Antikörper aus dem Tier den menschlichen Körper eingedrungen, indem sie sich eine Person eine starke Immunantwort verursachen würde.

Wenn es erforderlich ist, nicht nur eine effektive, sondern auch eine spezifische Bindung zu erhalten, wird es nicht schwierig sein, eine Selektionsstufe gegen nicht selektiv wechselwirkende Teilchen in das allgemeine Schema einzuschließen. Derzeit wird Phagen-Display nicht nur in kleinen Labors, aber auch in der Massenproduktion von Medikamenten und Reagenzien basieren auf Antikörpern (und Informationen über Peptide, die verschiedene Antigene binden, in einer öffentlich zugänglichen Datenbank gesammelt BDB). Hier sind einige Anwendungsgebiete: Nachweis von Antigenen in Testproben (insbesondere für diagnostische Zwecke), die Herstellung von Impfstoffen, Antitumor-Antikörper, Autoimmunreaktionen zu unterdrücken, Antitoxine Abgabe von Arzneimitteln an erkrankte Gewebe gerichtet (einschließlich Tumore). In den letzten zehn Jahren wurde diese Technologie für eine effizientere Evolution und Selektion von Proteinen mit enzymatischer Aktivität erlernt.

Abschließend sollten wir sagen, dass wir nicht am Ende des Weges stehen, sondern nur am Anfang (wie üblich). Die Notwendigkeit, die Zufallssuche zu verwenden, sagt uns, wie wenig wir noch wissen und wie schwach unsere Vorhersagefähigkeiten sind. Aber wenn sich das durch Versuch und Irrtum gewonnene Wissen anhäuft, bewegen wir uns immer noch darauf zu, die Auflösung des Bildes zu erhöhen, mit dem wir die Welt um uns herum beurteilen.

Tatjana Romanowskaja


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