Die Ergebnisse des ersten Jahrzehnts der CRISPR-Studie wurden zusammengefasst • Elena Naimark • Wissenschaftsnachrichten zu "Elementen" • Molekularbiologie, Mikrobiologie, Genetik

Ergebnisse des ersten Jahrzehnts der CRISPR-Studie

Abb. 1. Bakterium Streptococcus thermophilus, auf deren Grundlage die Existenz der erworbenen Immunität von Prokaryoten zum ersten Mal bewiesen wurde und ihr Mechanismus demontiert wurde. Fotos von mysticalbiotech.com

Vor 10 Jahren wurde ein Artikel von der Forschungsgruppe Danisco der Danisco Food Company veröffentlicht, in dem das Vorhandensein von erworbener Immunität in Prokaryoten nachgewiesen wurde und seine Arbeit auf der Grundlage der CRISPR-Transkripte demonstriert wurde. In diesem Jahrzehnt ist die erworbene Immunität von Bakterien und Archaeen aus der Kategorie exotischer Phänomene in der Mikrobenwelt in die Kategorie ihrer inhärenten Eigenschaften übergegangen. Studien haben gezeigt, wie es sich im Laufe der Evolution gebildet haben könnte, wie vielfältig molekulare Werkzeuge in der CRISPR-Immunität sind und vor allem, wie es eingesetzt werden kann. Das Potenzial für den mikrobiologischen und therapeutischen Einsatz von CRISPR-molekularen Instrumenten ist wirklich enorm, obwohl jüngste Arbeiten zeigen, dass sie für klinische Zwecke verbessert werden müssen.

Vor 10 Jahren fanden Rodolphe Barrangou und Philippe Horvath und Kollegen heraus, dass CRISPR in Prokaryoten mit dem Erwerb von Immunität assoziiert ist (siehe R. Barrangou et al, 2007. CRISPR liefert erworbene Resistenz gegen Viren in Prokaryoten). 10 Jahre sind eine sehr kurze Zeit für die Wissenschaft, aber eine ziemlich große Zeit für ein stürmisches revolutionäres Prinzip.Anlässlich des runden Datums veröffentlichten Barranga und Horvath, die diese Revolution ins Leben gerufen hatten, in der Zeitschrift Naturmikrobiografie Überprüfung der CRISPR-Forschungsgeschichte.

Daran erinnern, dass das CRISPR-System eine Reihe von palindromischen Wiederholungen ist, zwischen denen kurze Segmente der viralen DNA – die so genannten Spacer. Dieses System muss auch enthalten Cas-gens (Cas steht für CRISPR-assoziiert – "assoziiert mit CRISPR"). Das gesamte System ist darauf ausgelegt, die fremde Nukleotidsequenz zu erkennen und darauf zu fixieren. Danach werden Nukleaser-Scheren (Endonukleasen, die in Cas eintreten, oder andere Mittel, zum Beispiel RNasen) eingeführt, um virale DNA zu schneiden. Der Feind wird dadurch unschädlich gemacht. Aber das ist nicht genug: für ein Bakterium, das einen viralen Angriff überlebt hat, werden neue palindromische Segmente mit viralen Spacern am Anfang der Kassette hinzugefügt (siehe Gen-Kassette). Nun wird ein Stück DNA des besiegten Feindes in das Bakteriengenom eingefügt und auf die Nachkommen des Bakteriums übertragen. Genau so ist die erworbene Immunität in Bakterien und Archaeen organisiert. Es wird ständig aktualisiert, wenn eine Bakterienzelle auf virale Infektionen trifft.

In den späten 1980er Jahren erschienen die ersten Berichte über die Anwesenheit von Bakterien in Genomen (Escherichia coli, Tuberkelbazillus,sowie einige Cyanobakterien) und Archive einer Reihe von palindromischen Wiederholungen mit kurzen Inserts zwischen ihnen. Welche Art von Wiederholungen nötig sind und warum sie benötigt werden, war völlig unklar. Sie wurden nur als ein Hindernis bei der Zusammenstellung von Genomfragmenten wahrgenommen. In den 1990er Jahren, als die bakteriellen Genome massiv sequenziert ("gelesen") wurden, stellte sich heraus, dass Wiederholungen kein exotisches Element der DNA einzelner Bakterien und Archaea sind, sondern ein sehr häufiger Bestandteil ihrer Genome.

Im Jahr 2002 wurden diese Wiederholungen CRISPR genannt, was im Gegensatz zu früheren Vorschlägen (DVR – direkte variable Wiederholungen, TREP – Tandem – Wiederholungen, LTRR – lange Tandem wiederholte Wiederholungssequenzen, SRSR – kurze regelmäßige Wiederholungen, LCTR – große Cluster von Tandemwiederholungen) , SPIDR – Spacer eingestreute direkte Wiederholungen), in der Wissenschaft stecken. Die Funktion dieser Wiederholungen blieb jedoch unklar, bis 2005 die Arbeiten (gleichzeitig drei Artikel aus verschiedenen wissenschaftlichen Gruppen) herauskamen, in denen festgestellt wurde, dass die Spacer Fragmente von Virus- oder Plasmidsequenzen ähneln. Und nicht irgendwelche, sondern diejenigen, mit denen die untersuchten Bakterienpopulationen konfrontiert sind. Daher kann, wie in diesen Artikeln vorgeschlagen, die Wirkung von CRISPR-Systemen der RNA-Interferenz (Unterdrückung der Genexpression in den Stufen der Transkription, Translation oder Degradation von mRNA) ähnlich sein, obwohl es keine instrumentellen Analoga der RNA-Interferenz gibt Cas– keine Gegenstände.

Es folgte die Arbeit der wissenschaftlichen Gruppe des Industrie-Lebensmittelunternehmens Danisco, die sich insbesondere mit Bakterien für die Herstellung von Milchsäure-Produkten beschäftigte. Sie verwendeten CRISPR-Sequenzen, um zwischen Bakterienstämmen zu unterscheiden Streptococcus thermophilus (Abb. 1), die für die Herstellung von Joghurt verwendet werden. (Es ist klar, dass CRISPR für die Stämme sehr spezifisch sein sollte.) Wenn die CRISPR-Daten ausreichend waren, wurden sie einer Clusteranalyse unterzogen. Und plötzlich stellte sich heraus, dass die resultierenden Cluster palindromischer Wiederholungen mit der Resistenz gegen verschiedene Virusinfektionen korrelieren! Und, was noch wichtiger ist, zusätzliche Spacer mit palindromischen Segmenten finden sich in Bakterien, die einen viralen Angriff erfahren haben. In den frühen 2000er Jahren wurden bereits gegen lytische Phagen resistente Stämme verwendet. Nach dem Vergleich der Stämme, die in den 80er und 90er Jahren in der Industrie verwendet wurden, mit ihren resistenten Nachkommen aus den 2000er Jahren, wurde klar, was genau Resistenz gegen Infektionen bietet. Das Puzzle hat sich entwickelt: Die CRISPR-Spacer bestimmten die Immunität von Bakterienstämmen nach der Infektion.

Das Danisco-Team testete diese Annahme in einer Reihe von Experimenten: Die Stämme wurden mit bekannten Phagen behandelt und dann angepasstNukleotidsequenzen ihrer Genome. Außerdem versuchten sie, verschiedene Gene ein- und auszuschalten, einschließlich Cas. Und es stellte sich heraus, dass den CRISPR-Kassetten tatsächlich neue Palindrome mit viralen Spacern hinzugefügt wurden CasGene sind an der Bildung neuer CRISPR-Stellen beteiligt. Sie sind (insbesondere cas9) sind notwendig für die Erkennung und Neutralisierung von viralen Wirkstoffen. Die Hauptteilnehmer der erworbenen Immunität nahmen die Bühne – Palindrome, virale Spacer und eine Reihe von Genen Cas; skizzierte das Porträt des CRISPR-Cas-Systems, das erworbene Immunität in Bakterien bietet (siehe R. Barrangou et al., 2007. CRISPR bietet genehmigt).

Beachten Sie, dass, obwohl die Hypothese über die Hemmung der viralen DNA durch die Art der RNA-Interferenz 2006 vorgebracht wurde (siehe KS Makarova et al., 2006). , funktionale Analogien mit eukaryotischen RNAi und hypothetischen Wirkungsmechanismen), begann die Massenarbeit zur Untersuchung dieses Phänomens erst nach 2007 (Abb. 2). Es war wichtig, nicht nur eine effektive Hypothese aufzustellen, sondern die Realität des Phänomens zu beweisen und seine "Räder und Gänge" zu bestimmen. Dann besteht die Möglichkeit einer gezielten sinnvollen Forschung. Und sie folgten nicht langsam. Darüber hinaus erschütterte das Gefühl der erworbenen Immunität die wissenschaftliche Welt: Lamarck'sches Erbe in der WeltProkaryoten! evolutionärer Wettrüsten in Bakterien und Phagen! Bakterien haben einen besonderen Mechanismus gegen Fremd-DNA durch die Art der Interferenz in Eukaryoten! Cool!

Abb. 2 Die Geschichte der CRISPR-Forschung ist in vier Perioden unterteilt: "Antike" (1990-2000), "Das Mittelalter" (2000-2007), "Neue Geschichte" (2007-2013) und die Gegenwart. Die Chronologie der wichtigsten Werke in diesem Bereich wird gezeigt (Zahlen – Verweise auf diese Arbeiten, wie sie im Originalartikel von R. Barrangou, P. Horvath, 2017, enthalten sind. Ein Jahrzehnt der Entdeckung: CRISPR-Funktionen und -Anwendungen

Bald wurde ein ähnlicher Mechanismus entdeckt. E. coli. Und für Streptococcus thermophilus eine zusätzliche Bedingung ist offen für die Erkennung einer gezielten viralen Sequenz: Es ist notwendig, dass ein spezieller Satz von Nukleotiden davor steht Er erhielt den Namen PAM (Protospacer benachbartes Motiv, dh eine Reihe von Nukleotiden, die vor dem Proto-Explorer liegen). Und die Funktion von Cas9 offenbart sich auch: Es ist eine Endonuklease, die die DNA schneidet und sich genau 3 Nukleotide nach dem Protopacer zurückzieht. Und dann gab es Berichte über eine weitere Anforderung für das CRISPR-Erkennungssystem der Zielvirussequenz, die sogenannte tracrRNA (tracrRNA, trans-aktivierte CRISPR-RNA; siehe erworbene Immunität von Bakterien kann mit den Mechanismen der RNA-Interferenz in Verbindung gebracht werden, "Elements", 6. April 2011) ).TracrRNA ist eine Sequenz von 25 Nukleotiden, komplementär zum palindromischen Segment und lokalisiert auf dem gegenüberliegenden DNA-Strang von CRISPR. Deshalb hat sie das Präfix "trans" im Namen.

Wenn RNA aus einer CRISPR-Sequenz gelesen wird, wird eine lange, unreife Prä-mRNA mit 511 Nukleotiden erhalten. Es muss zuerst in die "richtigen" Stücke des Palindrom-Spacers geschnitten werden – die sogenannte crRNA (CRISPR-RNA). Hier schaltet sich die tracrRNA ein, verbindet sich mit dem Palindrom und erzeugt kurze Doppelstränge. In dieser Form können die Teilnehmer des CRISPR-Systems es lernen (Сas9, Сsn1, RNazIII). Das Auftreten eines RNA-Doppelstrangs im Zwischenstadium der Reifung verstärkt die Ähnlichkeit mit der RNA-Interferenz: Dort bildet sich auch ein Komplex aus zwei komplementären gepaarten RNA-Strängen, die Dicer erkennen und einen langen Strang in kurze Fragmente von 25 Nukleotiden schneiden kann.

In den folgenden Jahren haben Wissenschaftler gezeigt, wie vielfältig das CRISPR-System in Prokaryoten ist. Und wie es gewöhnlich der Fall ist, erscheinen nach der Anhäufung von Daten über die Vielfalt der konstituierenden Elemente Klassifikationen. CRISPR-Systeme sind nun in mehrere Klassen, Typen und Subtypen unterteilt, wobei der Schwerpunkt auf den Unterschieden in den funktionellen Elementen von Сas und dem Ziel-DNA- oder -RNA-Erkennungssystem liegt.Obwohl das Prinzip der erworbenen Immunität für alle Prokaryoten das gleiche ist – dieses System ist in DNA kodiert, um Abschnitte von fremder DNA oder RNA mittels RNA zu erkennen und mit Endonukleasen zu zerstören – gibt es viele Variationen.

Es gibt zwei Klassen von CRISPR (Fig. 3): In der ersten ist der Haupteffektor (Wirkstoff) der Proteinkomplex Cascade (CRISPR-assoziierter Komplex für die antivirale Abwehr) und die Endonuklease Cas3, in der zweiten Kaskade fehlt und Endonuklease Cas9 wirkt. In beiden Klassen gibt es notwendigerweise die Proteine ​​Сas1 und Сas2, daher nehmen sie nicht an der Klassifikation teil. Wie sich herausstellte, vervollständigen diese Proteine ​​neue Fragmente des Palindrom-Spacers zum Beginn der CRISPR-Kassette.

Abb. 3 Das Schema der CRISPR-Systeme und ihre Klassifizierung basieren auf Unterschieden in Cas- und Zielmolekülen (DNA oder RNA). Bild von R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Ein Jahrzehnt der Entdeckung: CRISPR Funktionen und Anwendungen

Die Unterscheidung zwischen Endonukleasen ist die Grundlage für die Unterscheidung von Typen innerhalb von Klassen. Typ 1 ist die Endonuklease Cas3, die einen der Doppelstränge der viralen DNA schneidet. Typ 2 ist Cas9, der beide Doppelstränge der DNA schneidet. Typ 3 – Cas10 (schneidet an bestimmten Stellen die Ziel-RNA). Typ 4 – Csf1 (zerstört doppelte DNA, aber wie ist das noch nicht bekannt). Typ 5 ist gekennzeichnet durch Cas12, das zwei Schnitte in einem Doppelstrang von DNA macht.Typ 6 – Cas13 ("zerkleinert" einzelsträngige Messenger-RNA in viele kleine Stücke). PAMs sind am Betrieb von Systemen der Typen 1, 2, 5 und 6 beteiligt (in Abbildung 3 sind sie mit Sternchen gekennzeichnet). Jeder dieser 6 Typen hat seine eigenen Unterteilungen: jetzt gibt es 19 Subtypen. Etwa 90% der Archaea und 40% der Bakterien in der einen oder anderen Form haben CRISPR-Schutz gegen Phagen und fremde mobile Elemente.

Forschung Cas erlaubt, die mögliche Evolution von CRISPR-Systemen zu rekonstruieren. Es wird angenommen, dass sie als ein Derivat von Enzymen erschienen, die wussten, wie man mobile Elemente in die Nukleotidsequenz schneidet und näht. Es wurde herausgefunden, als sie mögliche Vorfahren in Betracht zogen. cas1. Die Vorfahren dieses Proteins sind nicht mit CRISPR assoziiert, sondern beschäftigen sich mit dem genauen Schneiden und Einfügen von Transposons. Die Familie dieser Vorfahrenproteine ​​wird Casposon genannt (siehe M. Krupovic et al., 2015. Casposons: eine neue Superfamilie von selbst synthetisierender CRISPR-Cas-Immunität). Es ist klar, dass das Schneiden und Einfügen von Transposons dem Schneiden und Einfügen neuer Abstandshalter ähnelt. Daher ist ein ähnlicher Satz von Werkzeugen für beide Aktionen geeignet – Cas1 und seine modifizierten Derivate. Darüber hinaus weist das Caspozone eine terminale Sequenz von Wiederholungen auf, die sich leicht in CRISPR-Palindrome umwandeln und spezialisieren lassen.

Der starke Schutz von Bakterien und Archaeen in Form der ererbten CRISPR-Immunität ist durch das Wettrüsten von Wirt und Parasit entstanden. Bakterien entwickelten ein immer ausgeklügelteres Schutzsystem, und Viren entwickelten mehr und mehr raffinierte Wege, um diesen Schutz zu umgehen. Es ist sehr schwierig für Viren, den CRISPR-Schutz in der Bakterienpopulation zu besiegen, da verschiedene Bakterienzellen einen anderen Satz von Spacern tragen. Daher kann ein Phage, der sogar die Sequenzen an einer oder zwei Zielstellen (Protopacern) verändert hat und mit einer oder zwei crRNAs zurechtkommt, nicht gleichzeitig den gesamten Satz von Protopacenerstellen verändern. Wie Studien gezeigt haben, ist der Virusangriff, wenn die Bakterienpopulation zumindest etwas verschiedenartig ist, ein Fiasko (siehe Wissenschaftler haben herausgefunden, warum es für Bakteriophagen schwierig ist, das bakterielle Immunsystem zu bekämpfen, Elements, 18. April 2016). Daher hat das Wettrüsten dazu geführt, dass Viren einen anderen Weg eingeschlagen haben und "versucht" haben, ein gemeinsames Anti-CRISPR-System der Gegenwirkung zu organisieren. Es beinhaltet die Synthese kleiner Proteine ​​(deren Sequenzen in viraler DNA kodiert sind), die Cas-Proteine ​​einschließlich Cas9 inhibieren (siehe A. Pawluk et al., 2016. Natürlich auftretende Off-Switches für CRISPR-Cas9).Aus der Sicht des Virus ist dies eine sehr konstruktive Lösung.

Im Jahr 2011 wurden Arbeiten veröffentlicht, die die Möglichkeit einer Übertragung von CRISPR von einem Bakterium auf ein anderes bestätigten (siehe R.Sapranauskas et al., 2011) Streptococcus thermophilus CRISPR / Cas System bietet Immunität in Escherichia coli). Dies eröffnete wirklich enorme Möglichkeiten für den Einsatz des CRISPR-Cas-Systems. Hier begann die Idee des Genome Editing mit Hilfe dieses Toolkits. Denn wenn man an molekulare Scheren denkt, kann man selbstständig einen vom Forscher konzipierten Ort finden und genau dort schneiden, wo es gebraucht wird. Um dies zu tun, müssen Sie die Nuklease-Schere an die RNA-Sequenz mit dem Spacer und Palindrom, die geschnitten werden, wo der Forscher wollte – von den beiden Enden des Ziel-Fragments oder von einem. Und für was genau diese Schere zu verwenden ist – eine große Auswahl. Hier sind einige von ihnen.

Die Methoden zur Genotypisierung bakterieller Klone und Konsortien entlang eines einzigartigen Satzes von Spacern wurden signifikant verbessert. Dies führte zum Einsatz von CRISPR in der Lebensmittelindustrie. Nun ist es möglich, nicht nur die gewünschte Spannung durch die Sequenz von Spacern zu wählen, sondern auch die Reihenfolge ihrer Treffen mit Phagenagenten zu bestimmen, da die Sequenz der CRISPR-Spacer die Geschichte dieser Treffen widerspiegelt (Abb. 4).

Abb. 4 Solche Cluster können durch Untersuchung von CRISPR-Sequenzen in verschiedenen Stämmen erhalten werden: Stämme mit den gleichen Kassetten werden zusammen gruppiert (Cluster 1); in der anderen Gruppe gibt es Stämme mit zusätzlichen Abstandshaltern, die am Anfang der Kassette eingefügt sind (sie bedeuten kürzliche Angriffe durch Viren in Tochterstämmen) (Cluster 2); Es wird Gruppen mit einzigartigen Mengen von Spacern geben, die auf eine separate Geschichte der untersuchten Stämme hinweisen (Cluster 3, 4, 5). Bild von R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Ein Jahrzehnt der Entdeckung: CRISPR Funktionen und Anwendungen

Sie können neu erstellen oder die Resistenz von Bakterienstämmen gegen verschiedene Phagen erhöhen. Stabilität bedeutet in diesem Fall eine genaue Erkennung des Feindes und dessen Neutralisierung (es gibt andere Möglichkeiten, um Stabilität zu schaffen – zum Beispiel eine Barriere, um den Feind in die Zelle zu bringen). Um einen resistenten Stamm zu erzeugen, ist es notwendig, das synthetisierte RNA / DNA-System in die Zellen einzuführen.Cas. Außerdem wird das Bakterium unvermeidlich ein virales Stück in eine CRISPR-Kassette einbetten und die erforderliche Resistenz erhalten. Bei industriellen Belastungen tut ein solcher Widerstand nicht viel weh. So etwas wie eine Impfung. Oder auf die gleiche Weise, um die Dauerempfindlichkeit für Antibiotika für den experimentellen Stamm zu organisieren.Es ist bekannt, dass Bakterien in der Regel schnell eine Resistenz gegen Antibiotika entwickeln. Die Entwicklung von Resistenzen kann jedoch verlangsamt werden: Dazu müssen Sie eine CRISPR-Barriere für Plasmide setzen, die die genetischen Elemente des Widerstands tragen (Abb. 5).

Abb. 5 Der Mechanismus zur Resistenzentwicklung gegen Phagen oder mobile Elemente durch künstlich eingeführte Spacer. Bild von Rodolphe Barrangou, Philippe Horvath, 2017. Ein Jahrzehnt der Entdeckung: CRISPR Funktionen und Anwendungen

In diesem Zusammenhang ist es wichtig, dass das Schutzsystem nicht nur in prokaryotischen Zellen, sondern auch in Eukaryoten funktioniert. Natürlich ist eine eukaryotische Zelle nicht in der Lage, einen Spacer mit einem Palindrom in ihrem Genom zu platzieren, aber die Arbeitsversion von crRNA-Caswo RNA komplementär zur Zielsequenz im viralen Genom ist, wird sehr hilfreich sein. Daher wurde der Effekt von crRNA- mit großem Erfolg getestet.Cas gegen HIV. Wissenschaftler haben mit Zellkulturen gearbeitet, die mit diesem Virus infiziert sind. Indem sie sie mit crRNA-cas behandeln, die den Spacer von HIV trugen, befreiten sie die Zellen von der Infektion (siehe W. Hu et al., 2014. HIV-1-Infektion). Die crRNA fand virale Stellen, die in das Zellgenom eingefügt und mit Hilfe von Cas9 neutralisiert wurden. In diesem Fall war die Identifizierung und das Schneiden der Sequenz äußerst genau, es wurden keine "notwendigen" Fragmente der zellulären DNA beschädigt.Dies ist ein gutes Vorzeichen für die Heilung von HIV.

Und wenn der Stamm mit einem Phagen behandelt wird, dessen DNA mit Spacern aus dem Genom dieses Stammes künstlich in CRISPR-Fragmente eingefügt wird, beginnen die Bakterien sich selbst zu zerstören. Weil eine bakterielle Transkriptionsmaschine unweigerlich crRNA mit ihren eigenen Fragmenten liest, werden sie Komplemente auf ihrem bakteriellen Genom finden und sie mit ihren eigenen Nukleasen schneiden (Abb. 6). Dies ist das Schema des antimikrobiellen Schutzes.

Abb. 6 Die Infektion mit Phagen, die die Elemente des mikrobiellen Genoms in CRISPR-Kassetten tragen, und die Aktivierung dieses Systems führt zur Selbstzerstörung des Bakteriums. Bild von R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Ein Jahrzehnt der Entdeckung: CRISPR Funktionen und Anwendungen

Ein CRISPR-System kann angepasst werden, um das Genom zu editieren oder um das Lesen einzelner Gene zu stoppen. Im ersten Fall müssen CRISPR-Reparaturenzyme hinzugefügt werden (siehe DNA-Reparatur). Dann wird die crRNA an der richtigen Stelle der DNA-Sequenz beitreten, Endonukleasen werden sie schneiden, und die Reparaturproteine ​​werden die korrekte Sequenz vervollständigen (Fig. 7). Dies kann nützlich sein, um einzelne Mutationen zu suchen und zu bearbeiten. Im Falle der Hemmung der Transkription nimmt crRNA einfach den richtigen Platz ein,Die RNA-Polymerase ist blockiert und das Lesen wird gestoppt. Für solche Zwecke wird die Mutante Cas9 verwendet, die die DNA-Kette nicht schneidet.

Abb. 7 Bearbeiten, sowie Hemmung der Transkription in Bakterienzellen: Sie können die Mutation bearbeiten, indem Sie eine CRISPR mit einem mutierten Spacer in das Phagengenom einfügen; Dann werden crRNA mit einem mutierten Spacer betrachtet, ein Platz im bakteriellen Genom wird gefunden und von Reparaturproteinen bearbeitet; wenn ein Gen in diesem Konstrukt verwendet wird Cas9 mit mutantem Nykaza (dCas9), dann wird der richtige Ort gefunden, aber nachdem das System einfach blockiert ist. Bild von R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Ein Jahrzehnt der Entdeckung: CRISPR Funktionen und Anwendungen

Um mit eukaryotischen Zellen zu arbeiten, wird ein Konstrukt aus crRNA- und Cas-Proteinen konstruiert, die mit eukaryotischer DNA arbeiten. Es ist nicht einmal notwendig, CRISPR-cas-Trägerviren in die Zelle einzubetten. Wenn ein Bündel von crRNA-Molekülen mit dem Zielfragment und dem gewünschten Cas in die Zelle eintritt, dann verbindet sich die crRNA mit der DNA-Sequenz, die Nukleasen werden das gewünschte Fragment sorgfältig ausschneiden, und die Reparaturproteine ​​werden die korrigierte Sequenz erneut unter Verwendung der komplementären Matrix vervollständigen. Solche Arbeiten wurden zum Beispiel zur Sehkorrektur bei Ratten mit Retinitis pigmentosa durchgeführt (siehe W.-H. Wu et al., 2016).CRISPR-Reparatur zeigt (präklinisches Modell der Retinitis pigmentosa).

Retinitis pigmentosa ist eine Erkrankung, bei der die Bildung von Stäbchen in der Netzhaut gestört ist. Es wird oft in Menschen gefunden (36 Tausend Fälle werden jedes Jahr aufgezeichnet), aber für die Forschung gibt es ein Modell der Pigment-Retinitis bei Ratten. Es war bekannt, dass bei Ratten diese Krankheit durch eine von zwei Mutationen im Gen verursacht wird Pde6b (Mutanten mit Retinitis haben den Namen RD1) – entweder eine Punktmutation Y347X oder eine virale Insert Xmv-28, aber welche dieser beiden ist nicht klar. Die Aufgabe schien zu sein: herauszufinden, welche der beiden Mutationen Sehverlust verursacht und ob es möglich ist, die Mutation zu entfernen, um sie zu verbessern.

Zunächst haben Wissenschaftler eine Kombination von crRNA-Molekülen mit Cas9 erstellt, während in der RNA-Sequenz ein Abschnitt mit der Y347X-Mutation bereitgestellt wurde. Dann wurde ein Donormolekül, ein Oligonukleotid, mit einem normalen, nicht mutierten, zielgerichteten Fragment konstruiert. All dieser Komplex unter Verwendung von Plasmiden wurde zu einem befruchteten Rattenei mit Mutationen von Retinitis geschickt. Es wurde angenommen, dass crRNA-Cas9 den mutierten Teil der DNA ausschneidet, und in der Zwischenzeit wird ein normales Oligonukleotid als Basis für die Vervollständigung des geschnittenen Stücks dienen (Fig. 8).

Abb. 8 Das Schema des Experiments mit der Mutation Y347X: im Exon des mutierten GensPde6b (rd1) sollte schließlich in ein Stück TAT-Nukleotide anstelle von TAA eingefügt werden; Um dies zu tun, muss das TAA-Stück zuerst sorgfältig ausgeschnitten werden und dann wird die TAT korrekt vervollständigt. Bild von W.-H. Wu et al., 2016. CRISPR-Reparatur zeigt ein präklinisches Modell der Retinitis pigmentosa

Aus den so behandelten Zygoten entwickelten sich normale Ratten, in denen verschiedene Parameter visueller Funktionen getestet wurden. Im Allgemeinen funktionierte die Behandlung: bei 7 von 11 Tieren sah die Netzhaut ziemlich gesund aus (9), die Anzahl der Stäbchen war relativ normal und die physiologischen Reaktionen auf Licht in der Netzhaut erholten sich ebenfalls. Es stimmt, dass die Indikatoren des rechten und des linken Auges in einigen Fällen unterschiedlich waren, wie die Forscher betonen. Dies bedeutet, dass Insertionen und Reparatur in einem Mosaikmuster stattfanden, und zwar nicht nur im Zygotestadium, sondern später, als die Bildung symmetrischer Strukturen des Embryos stattfand.

Abb. 9 Blick auf den Augennerv-Fundus bei gesunden Ratten, in MutantenPde6b (rd1) und in mit dem crRNA-Cas9-Komplex gehärtet; im ersten und letzten Fall sind normale Blutgefäße und eine normale Netzhaut und im zweiten degenerative Strukturen sichtbar. Bild von W.-H. Wu et al., 2016. CRISPR-Reparatur zeigt ein präklinisches Modell der Retinitis pigmentosa

Die Autoren schlussfolgern daher, dass es durch Editieren des mutierten Gens möglich war,beweisen, dass bei Ratten die Retinitis pigmentosa durch eine Punktmutation, nicht durch eine virale Insertion verursacht wird (sie blieb bei den geheilten Ratten unverändert). Zweitens, und vor allem, korrigieren Sie erfolgreich die visuellen Funktionen von Mutanten. In der Tat wird diese Krankheit beim Menschen durch eine Mutation in einem ähnlichen Gen verursacht.

Diese Arbeit hatte auch eine Fortsetzung (siehe K. A. Schaefer et al., 2017. Unerwartete Mutationen nach CRISPR-Cas9-Editing in vivo), was den fortschrittlichen wissenschaftlichen Prozess sowohl im Allgemeinen als auch in einem einzigen Labor widerspiegelt. Die gleiche Gruppe prüfte, ob die CRISPR-Bearbeitung für das Tier sicher war und ob es unerwünschte Konsequenzen hatte. Eine solche Studie ist im Prinzip notwendig, da jedes therapeutische Mittel keine ernsthaften Nebenwirkungen haben sollte. Und wenn Sie Retinitis behandeln, so dass an anderen Stellen des Genoms keine unnötigen Mutationen erscheinen. Dieser Scheck dauerte ein Jahr. Dazu war es notwendig, die vollständige Genom-DNA-Sequenzierung der geheilten Ratten durchzuführen und dann die Anordnung der erhaltenen Mutationen mit möglichen Mutationen im Wildtyp und in unbehandelten Ratten aus der Mutantenlinie zu vergleichen RD1. Einzigartige Mutationen, die nur bei geheilten Ratten aufgetreten sind, und werden höchstwahrscheinlich diese unerwünschten Anhänge sein.

Es gab überraschend viele solcher einzigartigen Mutationen, etwa anderthalb Tausend.Von diesen sind 1397 in Punktmutationen und 117 in Insertionen und Deletionen, was ungefähr hundertmal höher ist als der übliche Mutationshintergrund. Es wird angenommen, dass, wenn crRNA-Cas9 in Betrieb ist, eher unerwünschte Insertionen oder Deletionen erwartet werden. Aber das Bild ist genau das Gegenteil, die meisten Punktmutationen. Diese Zahlen bedeuten, dass Projektionen von Seitenmutationen, basierend auf bioinformatischen Analysen, einige wichtige Faktoren unterschätzen können. Und bis die Schätzmethoden verbessert sind, ist es besser, sich auf genomweite Sequenzierung zu verlassen. Es ist klar, dass die Methode immer noch technisch verfeinert werden muss, obwohl ihr therapeutisches Potenzial außergewöhnlich hoch ist.

Quellen:
1) Rodolphe Barrangou, Christophe Fremaux, Hélène Deveau, Melissa Richards, Patrick Boyaval, Sylvain Moineau, Dennis A. Romero, Philippe Horvath. CRISPR bietet erworbene Resistenz gegen Viren in Prokaryoten // Wissenschaft. 2007. V. 315, S. 1709-1712. DOI: 10.1126 / science.1138140.
2) Rodolphe Barrangou, Philippe Horvath. Ein Jahrzehnt der Entdeckung: CRISPR-Funktionen und -Anwendungen // Natur Mikrobiologie. 2017. V. 2. Artikelnummer: 17092. DOI: 10.1038 / nmicrobiol.2017.92.
3) Wen-Hsuan Wu, Yi-Ting Tsai, Sally Justus, TingTing Lee, LiJuan Zhang, Chyuan-Sheng Lin, Alexander G. Bassuk, Vinit B. Mahajan, Stephen H. Tsang. Die CRISPR-Reparatur zeigt ein präklinisches Modell der Retinitis pigmentosa Molekulare Therapie. 2016. V. 24. I. 8. P. 1388-1394. DOI: //dx.doi.org/10.1038/mt.2016.10.
4) Kellie A. Schaefer, Wen-Hsuan Wu, Diana F. Colgan, Stephen H. Tsang, Alexander G. Bassuk, Vinit B. Mahajan. Unerwartete Mutationen nach CRISPR-Cas9-Editing in vivo // Natur Methoden. 2017. V. 14. P. 547-548. DOI: 10.1038 / nmeth.4293.

Elena Naimark


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