Eine alternative Methode der DNA-Replikation erwies sich als wirksamer als die traditionelle Methode. • Alexander Markov • Wissenschaftsnachrichten zu den "Elementen" • Genetik

Eine alternative Methode der DNA-Replikation erwies sich als effizienter als die traditionelle

Abb. 1. Das Replikationsinitiationsschema (z. B. Hefe; in Archaeen geschieht alles in ähnlicher Weise, weil das DNA-Replikationssystem von Eukaryoten von Vorfahren, Archaea, vererbt wird). Zuerst zum Replikationsstartpunkt (Herkunft) Angehängter Proteinkomplex ORC (Origin Recognition Complex). Dies trägt zur Anheftung des MCM-Komplexes bei (replikative Helikase, die für das Abwickeln der Doppelhelix während der Replikation verantwortlich ist). Dann werden andere Proteine, die für die Initiation der Replikation notwendig sind, hinzugefügt. Unten Es werden zwei Replikationsgabeln gezeigt, die sich vom Replikationsursprung in beide Richtungen bewegen. Bild von www.paterson.man.ac.uk

Der Prozess der Verdopplung von DNA-Molekülen (Replikation) beginnt an spezifischen "Replikationsstartpunkten" (TNR) – DNA-Segmenten mit einer spezifischen Sequenz von Nukleotiden, die an Proteine ​​gebunden sind, die die Doppelhelix auflösen und die Replikation initiieren. Im Genom der salzliebenden Archaea Haloferax vulkanii fand vier Thp. Die Entfernung von ihnen, wie man erwarten würde, führt zu einer langsameren Replikation und Reproduktion von Mikroben. Die simultane Entfernung aller vier TNR beschleunigte jedoch merkwürdigerweise die Replikation und ließ Archaea sich schneller vermehren.In Abwesenheit von TNP wird die Replikation durch die "unkonventionelle" Methode an beliebigen Stellen des Chromosoms unter obligatorischer Beteiligung von Enzymen initiiert, die Stellen zwischen DNA-Molekülen austauschen (homologe Rekombination). Die Entdeckung lässt Sie darüber nachdenken, warum TNR überhaupt benötigt werden und wie sie zustande gekommen sind. Vielleicht waren sie anfangs "egoistische Gene", die sich nur um ihre eigene Fortpflanzung kümmerten, aber dann eine "molekulare Domestikation" durchmachten und anfingen, Vorteile zu bringen, indem sie dazu beitrugen, die Replikation von Chromosomen zu regulieren und zu organisieren.

Alle lebenden Organismen im Genom haben "Replikationsstartpunkte" (THP) -spezifische Nukleotidsequenzen, die dazu dienen, Proteine ​​anzulagern, die die DNA-Replikation initiieren (1). Die Struktur und Anzahl der TNR in verschiedenen Organismen ist unterschiedlich. Viele Bakterien, deren Genom durch ein einzelnes zirkuläres Chromosom repräsentiert wird, haben nur ein THP pro Genom. Die Replikation, die an diesem Punkt beginnt, bewegt sich in beide Richtungen, bis zwei Replikationsgabeln verbunden sind und zwei von einem Ringchromosom produziert werden. Archaea haben normalerweise mehrere TNRs auf einem einzigen zirkulären Chromosom.Für Eukaryoten ist das Vorhandensein von mehreren THPs auf jedem linearen Chromosom (bis zu einhunderttausend pro Genom) charakteristisch. Ein unabhängiger Start der Replikation an vielen Stellen gleichzeitig beschleunigt den Prozess.

Mikrobiologen von der Universität Nottingham untersuchten die Arbeit der TNR an einem wichtigen Modellobjekt – halophilen (salzliebenden) Archaea Haloferax vulkaniiWohnen im Toten Meer und gilt als extrem archaischer Mikroorganismus.

Um THP zu identifizieren, sequenzierten die Autoren die DNA aus einer Vielzahl von Zellen und zeichneten die Anzahl der sequenzierten Fragmente auf ihrer Position auf dem Ringchromosom auf. H. vulkanii. Da die Replikation mit THP beginnt, sollten die Zellen die meisten Kopien der Bereiche neben dem THP aufweisen (sie können bereits repliziert werden, während die verbleibenden Sites in einer einzigen Kopie verbleiben). In solchen Graphen haben TNR die Form von scharfen Peaks, die durch geglättete "Täler" getrennt sind.

Die Analyse zeigte, dass der Laborstamm H. vulkaniiDie Forscher arbeiteten auf einem einzigen zirkulären Chromosom mit vier TNPs, die sich in ihrem Aktivitätsgrad unterscheiden (Abb. 2a).

Abb. 2 Die Abhängigkeit der Anzahl der Kopien der sequestrierten DNA-Fragmente von der Stelle auf dem Chromosom (das zirkuläre Chromosom wird entlang dem aktivsten Punkt des Beginns "geschnitten")Replikationen, oriC1). a – Die ursprüngliche Belastung. Peaks in der Grafik entsprechen vier THP: oriC1, ori-pHV4, oriC3, oriC2). b – ein Stamm, in dem alle vier TNPs entfernt wurden. Bild aus dem Artikel in der Diskussion Natur

Um herauszufinden, wie wichtig diese vier THPs für die Mikrobe sind, konstruierten die Autoren archaeale Stämme, in denen ein, zwei, drei oder alle vier THPs aus dem Genom entfernt wurden. Zur großen Überraschung der Forscher erwiesen sich alle diese Stämme als rentabel – selbst wenn sie überhaupt keinen Ausgangspunkt für die Replikation haben! Darüber hinaus ist es diese Dehnung, die völlig frei von THP ist, am schnellsten multipliziert (7,5% schneller als die ursprüngliche Dehnung mit vier THP). Die Entfernung der drei aktivsten TNRs erhöht die Reproduktionsrate um 5,5% im Vergleich zum Original. Die Entfernung einer TNR führt dagegen zu einem langsameren Wachstum. Die Entfernung von zwei TNPs aus vier hat wenig Auswirkung auf die Reproduktionsrate (abhängig davon, welche TNRs entfernt werden, nimmt sie entweder ein wenig ab oder nimmt ein wenig zu). Im Allgemeinen gibt es in den modifizierten Stämmen keine direkte (wie man erwarten würde), sondern eine inverse Korrelation zwischen der Aktivität der verbleibenden (nicht entfernten) TNR und der Reproduktionsrate.

Diese paradoxen Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die TNR ausgeht H.Vulkanien ein anderer Replikationsinitiationsmechanismus wird aktiviert, der um so effektiver arbeitet, je schwächer die Aktivität der verbleibenden TNRs ist. Es ist am einfachsten anzunehmen, dass in diesem Fall einige zusätzliche "ruhende" THP aktiviert werden (dieses Phänomen ist in Hefe bekannt). Diese Hypothese kann getestet werden, indem ein Graph der Anzahl von Kopien von DNA-Fragmenten konstruiert wird, die uns bereits an ihrem Ort auf dem Chromosom bekannt sind. Wenn die schlafenden TNPs aufgewacht sind, sollte dies als neue Spitze in der Grafik erscheinen. Die Kurve für einen Stamm ohne THP erwies sich jedoch als glatt, es traten keine neuen Peaks auf (Abbildung 2b). In den Stämmen mit getrennten einzelnen TNPs konservierten die Graphen alte Peaks, die den verbleibenden TNRs entsprachen, aber sie wurden von den spitzen TNRs geglättet.

Daraus folgt, dass es sich um einen solchen alternativen Mechanismus der Replikationsinitiation handelt, der an beliebigen Stellen des Chromosoms arbeitet und nicht von den spezifischen Nukleotidsequenzen von THP abhängt. Was ist dieser Mechanismus?

Einige Viren initiieren die Replikation mittels homologer Rekombination (siehe Homologe Rekombination) – den Austausch ähnlicher Stellen zwischen zwei DNA-Molekülen.Im Zuge der homologen Rekombination verteilt sich die Doppelhelix der DNA lokal, was Voraussetzungen für die Bildung einer Replikationsgabel schafft. Die homologe Rekombination dient insbesondere zur Reparatur (Reparatur) von DNA-Brüchen (Doppelstrangbruchreparatur). In diesem Fall wird die zweite (vollständige) Kopie des gebrochenen Chromosoms als Matrix zum Aufbringen eines Patches auf den beschädigten Bereich verwendet. Es ist bekannt, dass die Bakterien (Escherichia coli) Die DNA-Reparatur kann die Replikation initiieren (dies wird "DNA-Schaden-induzierte Replikation", DNA-Schaden-induzierbare Replikation) genannt. Vielleicht hat ein Archaea ohne Replikationsstartpunkte einen ähnlichen Prozess?

Um diese Hypothese zu überprüfen, versuchten die Autoren, das Gen aus den experimentellen Mikroben zu entfernen RadA, dessen Produkt die homologe Rekombination in Archaeen katalysiert (verwandte Gene mit der gleichen Funktion existieren in Bakterien und Eukaryoten, siehe: Seitz et al., 1998. RadA-Protein ist ein archaeales RecA-Protein-Homolog, das katalysierte DNA). Wild H. vulkanii ohne Gen RadA überleben irgendwie, obwohl sie keine homologe Rekombination durchführen können. In der Natur hätten sie nicht überlebt, weil sie DNA – Brüche, die unter dem Einfluss harter Sonneneinstrahlung in den Oberflächengewässern des Toten Meeres (Archaeen) entstehen, nicht effektiv vernähen konnten H. vulkanii werden mit Hilfe von Polyploidie und homologer Rekombination vor Strahlung geschützt, wie deynokokkam, die in den Nachrichten beschrieben sind Entwirrte das Geheimnis einer Mikroben, die keine Angst vor Strahlung hat, "Elemente", 03.10.2006). Aber im Labor können sie leben und sich vermehren. Nach dem Entfernen (oder Herunterfahren) bewährt RadA auch Stämme, denen Teile von THP fehlen. Aber um ein lebensfähiges Bakterium zu bekommen, ohne RadA und alle vier TNR scheiterten die Forscher. Zusätzliche Experimente bestätigten, dass in Abwesenheit von TNP die Fähigkeit zur homologen Rekombination für die DNA-Replikation absolut notwendig ist.

Es wurde zuvor gezeigt, dass einige Mutantenstämme von E. coli E. coli kann auch die Replikation unter Verwendung von homologer Rekombination einleiten, wenn TNP entfernt wurde. Aber solche Bakterien wachsen sehr schlecht. Mit anderen Worten, der Verlust von TNR reduziert dramatisch ihre Fitness. Im Gegensatz dazu, Archaea Reproduktionsrate H. vulkanii nach dem Entfernen aller vier TRNs, nicht nur nicht verringert, sondern sogar erhöht. Wie erklärt man es?

Die Antwort liegt vielleicht in der Konkurrenz zwischen den beiden Mechanismen der Replikationsinitiation für den MCM-Proteinkomplex, der für die Abspaltung der Doppelhelix zuständig ist (siehe Abb. 1).Wenn alle vier TNPs aktiv sind, verbrauchen sie alle zellulären MCM-Bestände. Wenn TNP ausgeschaltet wird, werden einige MCM-Moleküle freigesetzt und beginnen, sich den sogenannten D-Schleifen (siehe D-Schleife) anzuschließen, die sich dort bilden, wo eine homologe Rekombination auftritt. Offensichtlich ist der alternative Initiierungsmechanismus effizienter, aber er verliert den traditionellen Initiierungsmechanismus im Wettbewerb um MCM.

Aber warum brauchen wir Replikationsstartpunkte, wenn sie nicht vorhanden sind? H. vulkanii multipliziert sich schneller, zumindest im Labor? In der Tat bedeutet das, dass THP sind schädlich dieser Mikroorganismus!

Abb. 3 Archea Haloferax vulkanii unter dem Rasterelektronenmikroskop. Mikroben werden im Prozess der Paarung gefangen (Konjugation). Zwischen den Zellen, die die DNA tragen, sind Brücken sichtbar. Maßstabsbalken – 1 Mikron. Bild aus dem Artikel Rosenshine I., Tchelet R., Mevarech M. 1989. Der Mechanismus des Archaebakteriums

Um diese paradoxe Tatsache zu erklären, haben die Autoren eine überraschend kühne und schöne Hypothese aufgestellt. Sie deuteten an, dass THP ursprünglich als genomische Parasiten entstanden sei – egoistische DNA-Fragmente, die sich ausschließlich um ihre eigene Replikation kümmern. Die Fähigkeit von TNR, die MCM-replikative Helikase in einem solchen Fall effektiv anzuziehen, kann als Anpassung des Parasiten an seine parasitäre Lebensweise angesehen werden.Parasitäre THP könnten sich in Populationen von Mikroben, die häufig Gene miteinander austauschen, schnell ausbreiten (H. Vulkanien – nur von solchen, siehe Abb. 3).

Es ist merkwürdig, dass die Archaeen neben jedem TNP normalerweise das Gen für das ORC1-Protein enthalten, das diese bestimmte TNR erkennt (siehe Abb. 1). Eine solche Nachbarschaft eines Erkennungs-Proteingens mit einer erkennbaren Nukleotidsequenz ist charakteristisch für "egoistische" DNA-Segmente, wie etwa mobile genetische Elemente.

In Zukunft könnten egoistische TNRs eine "molekulare Domestikation" durchmachen (siehe: Das Opossum-Genom lesen, was die Schlüsselrolle von Transposons in der Evolution von Säugetieren belegt, Elemente, 13. Mai 2007) und beginnen, der Wirtszelle zu nutzen. Die meisten Mikroben THP helfen, die Replikation zu kontrollieren und zu rationalisieren. Dies ist für jene Mikroben notwendig, die ihre Ploidie sorgfältig regulieren und zwischen der Phase der DNA-Replikation und der Phase der Segregation (chromosomale Divergenz zwischen Tochterzellen) unterscheiden. Für solche Mikroben ist es wichtig, dass der nächste Replikationsakt nicht beginnt, bis der vorherige abgeschlossen ist. Aber du H. vulkanii viele Kopien des Chromosoms in jeder Zelle.Offensichtlich findet zwischen diesen Kopien eine aktive homologe Rekombination (cross-over) statt, die der polyploiden Mikrobe hilft, die Akkumulation schädlicher rezessiver Mutationen zu vermeiden. Wegen der hohen Ploidie braucht es sich um die genaue Trennung nicht zu kümmern, noch beugt es den überlappenden Replikationsakten vor (nebenbei bemerkt, was es nicht stört), folgt aus der Tatsache, dass die Graphik in Fig. 2a an einigen Stellen aufsteigt höher als 2: dies bedeutet, dass in jeder Zelle die Anzahl der Kopien der Chromosomenregionen in der Nähe der TNR die Anzahl der Kopien weit von den TNR-Regionen mehr als verdoppeln kann). Daher sind solche "archaischen" Mikroben wie H. vulkanii, Replikationsstartpunkte sind nicht sehr notwendig. Aus diesem Grund zeigen ihre TNRs immer noch ihre ursprüngliche parasitäre Natur, während sie in fortgeschritteneren Prokaryoten lange nützliche Teile des Wirtsgenoms geworden sind.

Vielleicht ist die Hypothese über den parasitären Ursprung der Replikationspunkte und ORC-Proteine ​​noch nicht ausreichend begründet und "weit hergeholt". Aber selbst wenn die TNR sofort als eine nützliche Anpassung erschien (und der scheinbare Schaden, den sie einigen Archaea zufügen, ist eine Art seltsamer Verirrung),Die erhaltenen Ergebnisse sind immer noch sehr nützlich, um die evolutionären Wurzeln eines so wichtigen molekularen Mechanismus wie der DNA-Replikation zu verstehen. An dieser Stelle sei daran erinnert, dass nach der Hypothese von Evgeny Kunin und seinen Kollegen der letzte gemeinsame Vorfahr aller lebenden Organisationen (LUCA, Last Universal Common Ahnen) bereits DNA hatte, aber noch keinen Mechanismus für seine Replikation hatte. Neue DNA-Moleküle wurden auf der RNA-Matrize durch reverse Transkription erzeugt. Der DNA-Replikationsmechanismus entwickelte sich dann unabhängig in zwei Hauptentwicklungszweigen von LUCA-Nachkommen: in Bakterien und Archaea (Leipe et al., 1999. Entwickelte sich die DNA-Replikation zweimal unabhängig voneinander?). Hierfür waren anscheinend einige Proteine, die an der homologen Rekombination beteiligt waren, nützlich (dieser Prozess ist viel älter als die DNA-Replikation). Zum Beispiel stammt die replikative Helikase von DnaB-Bakterien (die gleiche Arbeit wie das MCM in Archaea und Eukaryoten) von dem Schlüsselprotein der homologen Rekombination RecA (homolog zu RadA, oben erwähnt) (Leipe et al., 2000). Die bakteriell replizierende Helicase DnaB entwickelte sich aus einer RecA Duplizierung). Ein anderes Beispiel, das zeigt, dass die Funktionen von replikativer Helikase und homologem Rekombinationskatalysator nahe genug sind, so dass Proteine ​​sich gegenseitig verändern können, wird in den News Crossing-Fliegen durch Proteine ​​gesteuert, die für die DNA-Replikation verantwortlich sind, Elements, 11.12. 2012

Quelle: Michelle Hawkins, Sunir Malla, Martin J.Blythe, Conrad A. Nieduszynski und Thorsten Allers. Beschleunigtes Wachstum der DNA-Herkunft // Natur. Veröffentlicht am 03. November 2013.

Siehe auch:
1) Das Geheimnis einer Mikrobe, die Strahlung nicht fürchtet, "Elemente", wurde am 03.10.2006 gelöst
2) Das Überqueren von Fliegen wird durch Proteine ​​kontrolliert, die bei anderen Tieren für die DNA-Replikation verantwortlich sind, Elements, 11.12.2012.

Alexander Markow


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