CRISPR-CAS9 System gelungen, in Aktion fotografiert zu werden • Anastasia Pashutova • Science News zu "Elementen" • Molekularbiologie, Genetik

CRISPR-CAS9-System gelang es, in Aktion zu schießen

Abb. 1. Der Mechanismus des Systems Crispr-Cas. 1 – DNA-Segment des Virus, das die Zelle zuerst getroffen hat (das Rot) wird in den CRISPR-Locus eingefügt, wo die DNA-Abschnitte von Viren, auf die die Zelle zuvor gestoßen ist, bereits gespeichert sind (bunte Pfeile). 2 – Auf der Basis der CRISPR-Bibliothek werden RNA-Guides erstellt, die mit dem Protein Cas einen Komplex bilden (lila Ovale). 3 – Wenn der Cas-RNA-Komplex virale DNA trifft (grün), die komplementär zur Führungs-RNA ist, verbindet sich mit ihr und zerstört sie, indem sie in Stücke schneidet. Bild von gesundheitsindustrie-bw.de

Trotz der mehr als zehnjährigen Geschichte, in der das CRISPR-Cas-System studiert und auf die Genombearbeitung angewendet wurde, hat es bisher noch niemand bei der Arbeit beobachtet. Japanische Wissenschaftler haben diese Lücke beseitigt und waren die Ersten auf der Welt, die ein Video von diesem Prozess mit einem Hochgeschwindigkeits-Atomkraftmikroskop erhielten. Es stellte sich heraus, dass die Elemente des Systems auf eine andere Weise an DNA-Moleküle binden als bisher angenommen: Sie krabbeln nicht auf der Suche nach dem richtigen Ort an diesen Molekülen entlang, sondern finden sie mithilfe von dreidimensionaler Diffusion.

Das CRISPR-Cas9-System, das für die gerichtete Genom-Editierung verwendet wird, hat sich bei Wissenschaftlern großer Beliebtheit erfreut.Die Anzahl der Artikel, die dieses System erwähnen, wächst jedes Jahr rasant (beginnend mit mehreren Artikeln im Jahr 2011 und endet mit mehr als zweitausend Artikel im Jahr 2017).

Erinnern Sie sich daran, dass CRISPR-Cas das Immunsystem von Bakterien ist. Wie unser Immunsystem, das hat:
1) Speicherzellen, deren Aufgabe es ist, sich an den "Feind" im Gesicht zu erinnern und Informationen über ihn zu speichern (zum Beispiel speichert eine spezielle Lymphozytenpopulation Informationen über eine zuvor verwendete Waffe gegen das infektiöse Agens und bildet eine sekundäre Immunantwort);
2) Zellen, die direkt gegen den Feind kämpfen (zum Beispiel T-Killer);
Bakterien haben auch einen Mechanismus zur Eliminierung von Infektionserregern. Nur bei Bakterien sind einzelne Zellen nicht für die Immunität verantwortlich, sondern Nukleinsäuren (DNA und RNA) und speziell dafür angepasste Proteine. CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats), ein Komplex repetitiver DNA-Segmente, liegt dem bakteriellen Immunsystem zugrunde. Zwischen ihnen gibt es Spacer – Separatoren mit genomischen Fragmenten von Viren – genetische "Porträts" von denen, mit denen dieses Bakterium bereits in Berührung gekommen ist. Dies ist eine eigentümliche Basis von Identitäten von Verstößen im Genom der Bakterien.

Es funktioniert so.Wenn ein Virus, den sie nicht zuvor gesehen hat und gegen den es gekämpft hat, in das Bakterium gelangt ist, hinterlässt sie ein kleines Stück viraler DNA, die im CRISPR-Locus gespeichert wird (Abb. 1). Danach ist es notwendig, die aus dem Virus erhaltene Nukleotidsequenz in eine Form zu überführen, die Cas-Proteine ​​targetieren kann. Dazu wird eine sogenannte guide RNA (gRNA) erzeugt, die das in die Base eingebrachte Stück virale DNA wiederholt. In der Regel werden RNA-Guides konstant und mit einer relativ geringen Geschwindigkeit erzeugt, aber wenn eine Zelle mit einem Virus oder unter stressigen Bedingungen kollidiert, erhöht sich die Geschwindigkeit signifikant. Nachdem RNA erzeugt wurde, bindet sie an den Cas-Protein-Komplex. Jetzt kann der Cas-gRNA-Komplex wie ein Polizist mit einer Kriminalidentität eine Zelle patrouillieren. Wenn ein Stück Fremd-DNA gefunden wird, das zu der Leit-RNA komplementär ist, bindet der Komplex an dieses Stück und die Cas-Proteine ​​spalten es wie eine molekulare Schere. Für weitere Informationen über diesen molekularen Mechanismus siehe zum Beispiel den Artikel von D. E. Dzhagarov, Smart Scissors for DNA.

Vor mehr als 20 Jahren, vor fast 30 Jahren entdeckt, war dieses System nur für Molekularbiologen von Interesse, die versuchten, die Eigenschaften dieses einzigartigen Schutzmechanismus zu verstehen.Im Jahr 2012 wurde das Potenzial von CRISPR-Cas9-Systemen als ein Werkzeug zur Bearbeitung des Genoms identifiziert, das gezielte genetische Veränderungen in praktisch jedem Organismus auslösen kann. In den Folgejahren gelingt es Wissenschaftlern mit Hilfe dieser Methode beispielsweise, Mäuse genetischer Erkrankungen (JR Mendell, LR Rodino-Klapac, 2016. Duchenne-Muskeldystrophie: CRISPR / Cas9-Behandlung) zu befreien, um Tiere von HIV zu heilen (C. Yin et al., 2017. In vivo-Exzision von Single-Guide-RNAs in Tiermodellen, und sogar die Genome des Embryos und Erwachsenen bearbeiten (siehe P. Liang et al., 2015. CRISPR / Cas9-vermittelte Gen-Editierung in menschliche dreikernige Zygoten und populäre Anmerkung D. Cyranoski chinesische Wissenschaftler, um die erste menschliche CRISPR-Studie zu entwickeln). Lesen Sie über die Geschichte und wichtigsten Ergebnisse der Anwendung dieser Methode in den Nachrichten Die Ergebnisse des ersten Jahrzehnts der CRISPR-Studie wurden zusammengefasst ("Elements", 13.07.2017).

Trotz erheblicher Fortschritte gibt es bis heute keine einzige direkte Beobachtung des Funktionierens dieses Systems. Diese Lücke wurde von einer Gruppe japanischer Wissenschaftler unter der Leitung von Mikhiro Shibata (Mikihiro Shibata) mithilfe eines Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskops (HS-AFM) geschlossen, mit dem Moleküle und sogar einzelne Atome abgebildet werden können. Artikel über die Studie in der Zeitschrift veröffentlicht Naturkommunikationen.

Mithilfe der HS-AFM-Bildgebung kann die Proteindynamik mit fantastischen Details identifiziert werden.Zum Beispiel gelang es früheren Wissenschaftlern, unter denen sich einige der Autoren der diskutierten Arbeit befanden, photoinduzierte Konformationsänderungen im Bakteriorhodopsin-Molekül zu erfassen (M. Shibata et al., 2010. Atom-Molekül-Mikroskopie und Beobachtung des Moleküls). Myosin, durch ein Aktin-Filament wandern (N. Kodera et al., 2010. Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie).

Das Funktionsprinzip eines Rasterkraftmikroskops basiert auf der intermolekularen Wechselwirkung zwischen der Oberfläche der Probe und der Sonde. Die Sonde ist eine nanoskalige Kante, die sich am Ende eines elastischen Cantilevers befindet. Die gescannte Oberfläche kann die Sonde anziehen oder abstoßen, wodurch sich der Cantilever verbiegt (Abb. 2). Diese Biegung wird mit Hilfe eines Lasers registriert, der von einem Cantilever reflektiert wird und auf einen empfindlichen Photodetektor trifft (siehe den Artikel von A. Kuramshin für Details. Betrachten Sie die Atome, berühren Sie das Molekül). Die Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie arbeitet nach dem gleichen Prinzip. Der einzige Unterschied besteht darin, dass der Cantilever verwendet wird, der tausendmal kleiner ist als der im klassischen AFM verwendete, der die Geschwindigkeit der Bilderfassung erhöht.

Abb. 2 Das Schema des Rasterkraftmikroskops. Bild von simple.wikipedia.org

Wissenschaftler selbst haben die notwendigen Moleküle für die Studie vorbereitet. Cas9-Protein wurde in E. coli-Zellen synthetisiert. E. coliund wurde dann durch Säulenchromatographie gereinigt. RNA-Targeting und Ziel-DNA synthetisiert in vitro. Zusätzlich wurde ein spezielles Substrat vorbereitet, auf dem anschließend Biopolymere aufgebracht wurden. Die folgenden Anforderungen gelten für Substrate, die für AFM verwendet werden: Die Oberfläche muss ausreichend glatt sein und die zu untersuchenden Objekte gut adsorbieren. Beim Scannen von Biomolekülen wurden meist Glimmersubstrate verwendet. Und obwohl solche Substrate eine hydrophile Oberfläche mit atomaren Anteilen von mehr als 100 Mikrometern aufweisen, haben sie verschiedene Nachteile – beispielsweise negative Oberflächenladung (die DNA stören kann, da Phosphatgruppen auch eine negative Ladung aufweisen) und die Fähigkeit, freie Diffusion zu unterdrücken Komplexe. Um diese Mängel zu beheben, modifizierten die Forscher die Glimmeroberfläche auf zwei verschiedene Arten:
1) behandelten die Oberfläche von Glimmer mit einer Lösung von APTES ((3-Aminopropyl) triethoxysilan), wodurch sich auf der Oberfläche von Glimmer ein Film bildete, der eine positive Ladung in Wasser aufwies.
2) eine Lipiddoppelschicht wurde auf der Glimmeroberfläche gebildet, wodurch Wechselwirkungen zwischen dem Cas9-RNA-Komplex und Glimmer minimiert wurden.

Das erste, was japanische Wissenschaftler taten, war zu versuchen, das Cas9-Protein zu fotografieren, ohne RNA zu steuern. Zuvor wurden Änderungen des Cas9-Proteins, die während seiner Operation auftraten, mittels Röntgenbeugungsanalyse (PCA) untersucht. Diese Methode erlaubt es, eine dreidimensionale Struktur eines Moleküls, beispielsweise eines Proteins, zu erhalten (siehe A. Oganov, 10 Fakten zur Kristallographie). Kurz gesagt, der Prozess zum Erhalten eines Bildes durch dieses Verfahren besteht aus den folgenden Schritten: Herstellen einer gesättigten Proteinlösung, die einer Reinigung unterzogen wurde, dem Prozess der Kristallisation der Probe, Sammeln von Röntgenstreuungsdaten und direkte Verarbeitung der Daten, einschließlich Computersimulationen.

Frühere Studien haben gezeigt, dass das Cas9-Molekül in einem freien Zustand eine starre Struktur aufweist. Um dies zu testen, nahmen japanische Wissenschaftler Kristallmodelle von einer anderen Gruppe von Forschern und verglichen sie mit ihren Bildern, die mit dem AFM erhalten wurden. Es stellte sich heraus, dass das freie Protein eine bewegliche Struktur aufweist, die sich von der starren Kristallstruktur unterscheidet (Abb. 3, b, c).Das heißt, die früher mittels XRD erhaltenen Daten erwiesen sich als irrelevant, da sie nicht der Struktur des Proteins in seinem natürlichen Zustand entsprechen.

Abb. 3 b– Kristallstrukturen, von links nach rechts: einzelnes Cas9, ein Cas9-RNA-Komplex, Cas9-RNA, verknüpft mit einer einzelsträngigen Ziel-DNA und Cas9-RNA, verbunden mit seinem Ziel (doppelsträngige DNA). Verschiedene Farben bezeichnete funktionelle Domänen des Proteins: grauweißes Stück – Alpha-Spiralklinge, das Rosa – die Nuklease-Domäne von HNH, die die Ziel-DNA spaltet, blau – die Nuklease-Domäne von RuvC, die eine Kette von ungezielter DNA spaltet, beige – PAM-Domäne, die ein spezielles Stück Ziel-DNA erkennt. c und d – sequentielle Bilder, die mit einem Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskop erhalten wurden: single Cas9 (c) und die komplexe Cas9-RNA ( d ). Kleiner Schwanz angedeutet ein PfeilDies ist ein Stück RNA, das aus dem Alpha-Helix-Lappen herausragt. Skalen rechts Zeigen Sie die Höhe des Objekts über dem Substrat an. Bild aus dem Artikel in der Diskussion Naturkommunikationen

Dann filmten die Forscher den Cas9-Komplex mit dem RNA-Guide. Anders als ein einzelnes Protein hatte der Cas9-RNA-Komplex eine stabile bilobierte Architektur, die der Kristallstruktur entsprach (Abb. 3, b, d, vglauch Video Nr. 2 von zusätzlichen Materialien zum diskutierten Artikel).

Der nächste Schritt war die Visualisierung der Bindung des Cas9-RNA-Komplexes an die Ziel-DNA. Zu Beginn wurden alle "Teilnehmer" auf der Oberfläche des Substrats adsorbiert: molekulare Komplexe von Cas9-RNA und Ziel-DNA. In dem Video können Sie sehen, dass der Cas9-RNA-Komplex spezifisch an sein DNA-Ziel bindet. All dies wurde in Abwesenheit von Magnesiumionen Mg durchgeführt2+. Die Ionen dieses Metalls sind für den ordnungsgemäßen Betrieb von Nukleasen notwendig, daher bindet der Komplex an DNA ohne Magnesium, aber es findet keine weitere Spaltung statt (Abb. 4; siehe auch Video Nr. 3 aus zusätzlichen Materialien für den diskutierten Artikel).

Abb. 4 Der Cas9-RNA-Komplex wird spezifisch (dh an einer spezifischen Stelle, wo das Schneiden stattfinden wird) in Abwesenheit von Mg-Ionen mit seinem Ziel assoziiert2+schneidet nicht die DNA. Bild aus dem Artikel in der Diskussion Naturkommunikationen

Um den Prozess des DNA-Bruchs sichtbar zu machen, wiederholten die Forscher den vorherigen Schritt, fügten jedoch bereits Magnesium hinzu. Dann konnte das Protein Cas9 die DNA schneiden. Das Video zeigt, wie nach dem Einfügen doppelsträngiger Brüche ein Teil der DNA aus dem Komplex freigesetzt wird (Abb. 5 und Video).

Abb. 5 Komplexe Cas9-RNA in Gegenwart von Mg-Ionen2+ schneidet die DNA. Weiße und rosa Pfeile zeigen die Nuklease-Domäne von NHN in einem inaktiven und aktiven Zustand an. Das freigesetzte Ende des DNA-Strangs ist gezeigt. blauer Pfeil auf dem letzten Rahmen. Bild aus dem Artikel in der Diskussion Naturkommunikationen

Komplexe Cas9-RNA schneidet DNA-Moleküle

Aufgrund der unzureichenden Auflösung von Bildern bleibt es leider unbekannt, wie der verbleibende Teil des DNA-Moleküls in dem Komplex freigesetzt wird.

Den Wissenschaftlern gelang es auch, die Theorie zu widerlegen, wie genau der Cas9-RNA-Komplex an die erforderliche Region des DNA-Moleküls bindet: Früher glaubte man, dass das an RNA gebundene Protein auf der Suche nach einer komplementären Region entlang der DNA "gleitet". Zu diesem Zweck verwendeten die Forscher ein Substrat auf Bilipidbasis, um die Wechselwirkung zwischen Glimmer und Protein zu minimieren, die die freie Diffusion des Komplexes beeinträchtigen kann. Es stellte sich heraus, dass Cas9 ohne eine Guide-RNA an das DNA-Molekül bindet und einfach entlang dieses gleitet. Wenn das Protein jedoch RNA hat, die komplementär zur gewünschten Stelle ist, rutscht der Komplex nicht ab, sondern ist direkt mit dem Target assoziiert (6, siehe auch Video Nr. 7 aus zusätzlichen Materialien für den diskutierten Artikel). Offenbar verhindert die Anwesenheit der Führungs-RNA, dass der Cas9-RNA-Komplex die DNA "überspannt", um entlang dieser zu gleiten.Die Bindung erfolgt also durch dreidimensionale Diffusion: Die Komplexe schwimmen in Lösung, und wenn sie Glück haben, in der Nähe des gewünschten DNA-Segments zu sein, binden sie sich daran.

Abb. 6 a – mehrere Cas9-Proteine ​​(markiert mit Pfeile), denen die dirigierende RNA fehlt, entlang des DNA-Moleküls gleiten. b – Komplexe Cas9-RNA bindet sofort an die gewünschte Stelle, sobald sie durch dreidimensionale Diffusion benachbart ist. Im zweiten Bild sind mehrere DNA-Moleküle zu sehen, an denen bereits der Cas9-RNA-Komplex sitzt (Pfeil nach unten), und auf der anderen Seite gibt es einen Ort, an dem später ein anderer Komplexoberer Pfeil). Im vierten und fünften Bild ist deutlich zu sehen, dass Cas9-RNA sofort an der richtigen Stelle erscheint und nicht entlang der DNA gleitet. Bild aus dem Artikel in der Diskussion Naturkommunikationen

Diese körnigen und scheinbar ungeschickten Videos lassen Wissenschaftler auf der ganzen Welt vor Freude jammern. Auf der einen Seite funktioniert das CRISPR-Cas9-System wie vorhergesagt. Auf der anderen Seite haben sich bereits neue Details gezeigt, wie der Proteinkomplex an das korrekte DNA-Segment bindet. Im Allgemeinen liefert diese Studie beispiellose Details über die funktionelle Dynamik von CRISPR-Cas9 und unterstreicht das PotenzialHochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie zur Bestimmung der Wirkungsmechanismen von Molekülen, die mit Nukleinsäuren assoziiert sind.

Quelle: Mikihiro Shibata, Hiroshi Nishimasu, Noriyuki Kodera, Seiichi Hirano, Toshio Ando, ​​Takayuki Uchihashi und Osamu Nureki. CRISPR-Cas9 Echtzeit- und Echtzeit-Dynamik, visualisiert durch Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie // Naturkommunikationen. 2017. DOI: 10.1038 / s41467-017-01466-8.

Anastasia Paschutowa


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