CRISPR / Cas gegen Huntington-Krankheit

CRISPR / Cas gegen Huntington-Krankheit

Tuyana Malankhanova, Suren Zakian
"Science Firsthand" №4 (75), 2017

Oben: "gesundes" Gen NTT, das das Protein Huntingtin kodiert. Unten: mutiertes Gen HTT

Laut dem Harvard Neuro Research Center leiden heute allein in den USA etwa 5 Millionen Menschen an Alzheimer; 1 Million – von Parkinson-Krankheit; 400 Tausend – von der multiplen Sklerose; Jeweils 30 Tausend – von der amyotrophen Lateralsklerose (Lou Gehrig-Krankheit) und Huntington-Krankheit. Diese Störungen, die zur Gruppe der neurodegenerativen Erkrankungen gehören, sind wenig verstanden und es gibt keine wirksamen Behandlungen für sie. Das Gen-Editing-Tool CRISPR / Cas9, das in der Biologie und Medizin aktiv und erfolgreich eingesetzt wird, kann helfen, dieses Problem zu lösen.

Über die Autoren

Tuyana Bairovna Malankhanova – Doktorand, Staatliche Universität Nowosibirsk, Oberlaborant, Labor für Epigenetische Entwicklung, Institut für Zytologie und Genetik, Sibirische Abteilung der Russischen Akademie der Wissenschaften (Novosibirsk). Autor und Co-Autor von 3 wissenschaftlichen Arbeiten und 1 Monographie.

Suren Minasovich Zakian – Doktor der biologischen Wissenschaften, Professor, Leiter des Labors für Entwicklungsepigenetik des Instituts für Zytologie und Genetik,das Stammzelllabor des Zentrums für Neue Medizinische Technologien des Instituts für Chemische Biologie und Grundmedizin der Sibirischen Abteilung der Russischen Akademie der Wissenschaften (Novosibirsk); Labor für Molekulare und Zelluläre Medizin, Nationales Medizinisches Forschungszentrum. Acad. E. N. Meshalkina (Novosibirsk), Laboratorium für zelluläre Entwicklung von FEN der staatlichen Universität Novosibirsk. Autor und Co-Autor von mehr als 200 wissenschaftlichen Arbeiten, darunter 33 Monographien und 5 Patente.

In den letzten Jahrzehnten hat sich die durchschnittliche Lebenserwartung einer Person erhöht, und heute leben mehr Menschen in dem Alter, in dem sich verschiedene mit dem Alter verbundene Krankheiten manifestieren können. Solche "Alterserkrankungen" umfassen neurodegenerative Erkrankungen, von denen die meisten durch den graduellen und selektiven Tod bestimmter Arten von Nervenzellen gekennzeichnet sind. Die Ursachen dieser Krankheiten sind meist Verstöße im Genom.

Betrachten Sie dieses Problem als Beispiel. Huntington-Krankheit (andere Namen sind Huntington-Syndrom, Chorea Huntington oder Huntington-Syndrom), manifestiert sich durch Symptome wie den zunehmenden Verlust der motorischen Kontrolle und psychische Störungen.Trotz der Tatsache, dass die genetische Mutation, die diese Krankheit verursacht, vor mehr als 20 Jahren identifiziert wurde, sind die molekularen Mechanismen ihrer Entwicklung immer noch nicht vollständig verstanden, ebenso wie keine wirksame Behandlung für diese Krankheit gefunden wurde.

Menschen mit Huntington-Krankheit haben abnorme und unkontrollierte Bewegungen fast aller Muskeln des Körpers ("St. Vitus Tanz"), sowie geistige und kognitive Beeinträchtigung. Diese schwere Krankheit beginnt sich normalerweise nach 35 Jahren zu manifestieren und hat einen progressiven Charakter.

Modellierung einer Krankheit

Die Ursache der Huntington-Krankheit ist eine Zunahme der Anzahl von Trinukleotid-CAG-Wiederholungen im HTT-Gen, das für ein Protein kodiert Jagd. Normalerweise enthält dieses Gen 8 bis 36 Wiederholungen, aber wenn diese Zahl 37 oder mehr erreicht, beginnt sich die Krankheit zu entwickeln. Triple CAG codiert die Aminosäure Glutamin. Dementsprechend wird Huntingtin bei der Huntington-Krankheit mit einer verlängerten Polyglutamin-Kette synthetisiert. Ein solches Protein hat eine unregelmäßige räumliche Struktur und kann seine Funktion in Zellen, die übrigens noch unbekannt sind, nicht erfüllen. Zusätzlich, in StriatumEiner der Teile des Gehirns, die den Muskeltonus regulieren, ein mutiertes Protein bildet Aggregate, die eine toxische Wirkung haben. In diesem Fall hängt die Schwere des Krankheitsverlaufs von der Anzahl der CAG-Wiederholungen ab.

Um die molekularen Prozesse zu erforschen, die zur Entwicklung der Pathologie führen, sowie um neue Medikamente zu testen, brauchen wir ein biologisches Modell, das menschliche Krankheiten so genau wie möglich reproduziert. Um ein Modell der Huntington-Krankheit zu erstellen, führten Wissenschaftler das mutierte humane NTT-Gen in das Genom von Labormäusen ein. Die Ergebnisse, die in solchen "Maus" -Modellen erhalten werden, spiegeln jedoch nicht immer genau die Prozesse wider, die im menschlichen Körper auftreten. Exit – Zelllinien von Menschen abgeleitet.

Um die Huntington-Krankheit zu untersuchen, ist es notwendig, Striatumzellen zu haben, aber es ist schwierig, ein solches Biomaterial zu erhalten. Dieses Problem wird gelöst durch induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs), die ziemlich leicht umprogrammiert werden können, können aus menschlichen Hautzellen oder Blut erhalten werden. Ferner können diese Zellen in unbegrenzten Mengen expandiert werden abgrenzen (transformieren) in fast jeden gewünschten Zelltyp.

Das genomische CRISPR / Cas9-Editing-System wird heute verwendet, um Zelllinien zu erzeugen, die die Huntington-Krankheit durch die Produktion induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS-Zellen) aus humanen somatischen Zellen modellieren.

Normalerweise werden bei der Modellierung von Krankheiten Zellen von kranken Menschen und als Kontrolle von einem gesunden Spender verwendet. Aufgrund der Anwesenheit im menschlichen Genom ist jedoch eine enorme Anzahl von einzelnen Nukleotiden vorhanden Polymorphismen Solche Paare von Zellen sind nicht ganz korrekt zu vergleichen. Die ideale Kontrolle für "kranke" Zellen wären Zellen mit genau dem gleichen Genom, aber ohne die Mutation, die die Krankheit verursacht. Solche Zellen werden genannt isogene Paare oder durch Linien. Erstellen Sie isogene Linien und verwenden Sie das Werkzeug, um die Gene CRISPR / Cas9 zu bearbeiten.

Erforschung der Genumgebung

Obwohl die Huntington-Krankheit ist monogene Erkrankungd. h. aufgrund einer Mutation in einem Gen sind mehr als 100 sogenannte Modifizierungsgene bekannt, die die Zeit der ersten Symptome, die Schwere der Erkrankung usw. beeinflussen können. Das bequemste Werkzeug zur Aufklärung der Rolle dieser Gene in der Pathogenese der Huntington-Krankheit ist CRISPR / Cas9 basierte GeCKO (Shalem et al., 2014).Es ermöglicht Ihnen, ganze Bibliotheken von Gen-Targets für CRISPR / Cas9 zu erstellen und Tausende von Genen in nur wenigen Schritten auszuschalten. So ist es möglich, in kurzer Zeit zu produzieren. Knockout (off) alle Modifikationsgene und finde heraus, wie sich dies auf die Lebensfähigkeit der Zellen, die Geschwindigkeit ihrer Teilung usw. auswirkt.

Mit Hilfe von Tools, die auf CRISPR / Cas9 basieren, können Sie nun nicht nur das Genom, also die Erbinformation, bearbeiten, sondern auch EpigenomDies spiegelt Änderungen in der Arbeit von Genen wider, die die Struktur der DNA nicht beeinflussen. Dank genomischer Bearbeitung haben wir die Möglichkeit, die Expressionsrate von Zielgenen zu verändern. Um dies zu erreichen, wurden bereits Werkzeuge entwickelt, die das "aus" Cas9 verwenden, an das verschiedene Enzyme gebunden sind, die in der Lage sind, das Produktionsniveau des einen oder anderen Proteins zu aktivieren oder im Gegenteil zu unterdrücken. Zum Beispiel ist es im Falle der Huntington-Krankheit möglich, die Synthese von mutiertem Protein spezifisch zu unterdrücken, wodurch die Bildung von Proteinaggregaten und der Tod von Striatumneuronen verhindert wird.

Sie können jedoch aktivieren und Verbindungen, die zur beschleunigten Entfernung oder den Abbau von Proteinen mit der falschen Struktur beitragen.Zum Beispiel wird dieser Effekt durch die Aktivierung von Hitzeschockproteinen erreicht (Chaperone) die abnormale Proteine ​​mit Todeszeichen versehen. Auf diese Weise markierte Proteine ​​gelangen in spezielle Zellstrukturen, wo sie zerstört werden.

Darüber hinaus können CRISPR / Cas9-basierte Epigenom-Modifikations-Tools das Niveau der Proteinsynthese durch Modifikation verändern Chromatin – ein kompakter Komplex von DNA, RNA und Proteinen in Chromosomen. Sie können solche Modifikationen am Chromatin vornehmen, was zu einer "lockereren" DNA-Faltung führt, die aktiviert Transkription (Lesen von genetischer Information über RNA). Andere Modifikationen können dagegen zu einer kompakteren DNA-Faltung beitragen und die Transkription verlangsamen oder sogar vollständig blockieren.

Wir behandeln?

CRISPR / Cas9 kann auch zur Behandlung der Huntington-Krankheit eingesetzt werden. Es gibt zwei Optionen für die Belichtung: die Verkürzung von CAG-Wiederholungen oder das gezielte Abschalten einer Mutationskopie eines Gens.

Im ersten Fall werden CRISPR / Cas9-Doppelstrangbrüche in einer Folge mit Wiederholungen eingefügt. Dieser Eingriff hat jedoch den gegenteiligen Effekt – eine Zunahme der Anzahl von CAG-Wiederholungen. Das Problem wurde gelöst mit Nikaz Cas9 – mutierte Proteine ​​Cas9, die Einzelstrangbrüche in der DNA bilden. Das Experiment zeigte, dass aufeinanderfolgende Einzelstrangbrüche in Regionen mit Wiederholungen im schlimmsten Fall die Länge des Abschnitts mit Wiederholungen nicht verändern und bestenfalls zu seiner erwarteten Verkürzung führen (Cinesi et al., 2016).

Das Schema zur Verkürzung des verlängerten Wiederholungstrakts des CAG-HTT-Gens unter Verwendung des Standard-CRISPR / Cas9-Systems, das doppelsträngige DNA in die DNA einführt, und unter Verwendung von Cas9-Nikac, die einzelsträngige Lücken einführt. Von: (Cinesi et al., 2016)

Sie können die Strategie verwenden, um das Gen in den seltenen Fällen auszuschalten, in denen zwischen zwei Kopien des NTT-Gens einzelne Nukleotidunterschiede bestehen. Wenn sich solche Polymorphismen auf beiden Seiten des Diagramms mit unregelmäßigen Wiederholungen befinden, können sie als Ziele für die CRISPR / Cas9-Schere verwendet werden. Gleichzeitig wird eine normale Kopie des Gens nicht beeinflusst (Shin et al., 2016).

Die Erforschung der Huntington-Krankheit mit dem CRISPR / Cas9-System wird heute in Russland durchgeführt. So wird im Labor für epigenetische Entwicklung des Instituts für Zytologie und Genetik der Sibirischen Abteilung der Russischen Akademie der Wissenschaften (Novosibirsk) an isogenen Stammzelllinien gearbeitet, die die Huntington-Krankheit durch Einführung verlängerter CAG-Signalwege in das normale NTT-Gen und Differenzierung von iPS-Zellen in Striatumneuronen modellieren.In Zukunft wollen die Nowosibirsker Forscher die Rolle von Modifikationsgenen in der Pathogenese dieser Krankheit anhand eines Zellmodells untersuchen.

Es besteht Grund zu der Hoffnung, dass die Forschungsergebnisse zu einer effektiven Behandlungsmethode führen werden. Darüber hinaus können sie bei der Untersuchung anderer neurodegenerativer Erkrankungen helfen, deren Entwicklung auf einer ähnlichen Mutation beruht.

Literatur
1. Medvedev S.P. Wie man Vererbung // Wissenschaft aus erster Hand bearbeitet. 2014. T. 55. Nr. 1. P. 10-14.
2. Cinesi C., Aeschbach L., Yang B., Dion V. Contracting CAG / CTG wiederholt die Verwendung der CRISPR-Cas9-Nickase // Nat. Gemeinschaft. 2016. V. 7. P. 13272-13281.
3. Shalem O., Sanjana N. E., Hartenian E. et al. Genom-Maßstab CRISPR-Cas9-Knockout-Screening in menschlichen Zellen // Wissenschaft. 2014. V. 343. N. 6166. P. 84-87.
4. Shin J.W., Kim K.-H., Chao M.J., et al. Permanente Inaktivierung der Allel-spezifischen CRISPR / Cas9-Mutation durch die Huntington-Krankheit // Hum Mol. Genet. 2016. V. 25. N. 20. P. 4566-4576.


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